【摘 要】
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研究背景:牙发育起始阶段,牙板上一系列局部区域细胞增殖活跃,增生的上皮向深层的结缔组织内折叠伸延,进一步增生形成最早期的成釉器,最终形成牙釉质。颅神经嵴来源的间充质在成芽状的牙胚周围凝结,成为所有牙齿组织除牙釉质外的指定间充质。来源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞（EMSCs）在牙齿发育和牙齿矿化中具有重要意义,形成除牙釉质以外的牙乳头细胞和牙囊细胞,随后形成除牙釉质以外的牙体硬组织以及牙周支持组织。
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研究背景:牙发育起始阶段,牙板上一系列局部区域细胞增殖活跃,增生的上皮向深层的结缔组织内折叠伸延,进一步增生形成最早期的成釉器,最终形成牙釉质。颅神经嵴来源的间充质在成芽状的牙胚周围凝结,成为所有牙齿组织除牙釉质外的指定间充质。来源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞（EMSCs）在牙齿发育和牙齿矿化中具有重要意义,形成除牙釉质以外的牙乳头细胞和牙囊细胞,随后形成除牙釉质以外的牙体硬组织以及牙周支持组织。牙齿的矿化是牙齿发育的重要过程,牙体硬组织的破坏往往是从牙齿的脱矿开始的,促进再矿化也是临床的一大难题。目前,关于牙齿矿化的机制还远未被完全揭示,这限制了牙齿组织工程和牙齿再生的进程。Mage-D1（MAGE家庭成员D1）,又称作Dlxin-1或NRAGE,参与细胞分化、细胞凋亡、细胞周期、肿瘤发生和转移等多种细胞生物学效应[5]。近年来关于Mage-D1在牙齿发育方面的研究越来越多,有研究表明Mage-D1参与了牙齿的矿化过程及干细胞的增殖分化等,但Mage-D1在牙齿矿化中的具体调控作用及机制仍不清楚,我们的前期研究指出,p75NTR通过改变成牙关键因子Dlx/Msx的活性参与牙发育调控,进一步发现Mage-D1可能是p75NTR的下游桥梁信使,参与了EMSCs的矿化与成牙分化。因此本研究进一步对Mage-D1在大鼠牙齿矿化中的调控作用进行了探讨。目的:本研究旨在通过动态组织学观察Mage-D1在大鼠牙胚发育中的表达模式和通过外胚间充质干细胞体外研究Mage-D1在大鼠牙齿矿化中的调控作用和机制初探。材料与方法:第一部分:Mage-D1在大鼠牙胚发育过程中的动态表达模式:取怀孕第12.5天、第15.5天、第19.5天（E12.5 d、E15.5 d、E19.5 d）的SD大鼠的胚胎头部及出生后1天、出生后4天（PN1、PN4）的SD大鼠上颌骨（每组至少3只）,进行组织包埋,制备石蜡切片,然后进行苏木素-伊红（HE）染色及Mage-D1的免疫组化染色。第二部分:Mage-D1对大鼠E19.5 d EMSCs的调控作用:体外分离E19.5 d EMSCs,并通过鬼笔环肽染色观察细胞骨架,流式检测细胞表面抗原进行验证。随后体外通过慢病毒转染技术过表达及沉默Mage-D1,并用免疫荧光染色、蛋白质印迹（WB）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）来验证转染效率。转染成功后进一步检测Mage-D1对E19.5 d EMSCs增殖及迁移的影响。随后在矿化诱导培养后,通过RT-PCR、WB、碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色来观察Mage-D1对大鼠E19.5 d EMSCs的矿化调控作用。第三部分:Mage-D1调控大鼠E19.5 d EMSCs矿化的机制初探:体外用免疫共沉淀检测Mage-D1与关键牙发育相关因子p75NTR,Msx1,Dlx1的结合状况,并通过RT-PCR、WB检测转染Mage-D1后p75NTR,Msx1,Dlx1基因及蛋白表达水平的变化。结果:第一部分:大鼠牙胚在E12.5 d、E15.5 d、E19.5 d、PN1、PN4分别对应为蕾状期,帽状期,钟状期,钟状晚期及牙根发育起始期。Mage-D1在大鼠牙胚发育过程中的表达具有时间和空间特异性,在矿化相关组织,如成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘、牙槽骨的成骨细胞以及牙釉质基质均有明显表达。第二部分:体外获取E19.5 d EMSCs,鬼笔环肽结果显示E19.5 d的EMSCs为均一的长梭形,表现为成纤维细胞样形态。流式细胞术检测E19.5 d EMSCs细胞表面抗原,结果显示间充质干细胞表面标记CD44、CD29,CD90,CD105和CD146的表达量分别为95.01%,95.25%,99.51%,94.96%,95.18%;造血干细胞表面标志物CD45为0.37%。Mage-D1转染后通过免疫荧光染色、RT-PCR和WB验证转染效率,转染成功后CCK-8检测结果显示Mage-D1正调控E19.5 d EMSCs的增殖能力,划痕实验结果显示Mage-D1负调控E19.5 d EMSCs的迁移。在矿化培养基的诱导下,Mage-D1促进E19.5 d EMSCs的矿化的能力。第三部分:免疫共沉淀结果显示,在体外以E19.5 d EMSCs为细胞模型,Mage-D1既可以和p75NTR结合,还与Dlx1、Msx1结合,过表达Mage-D1后,p75NTR、Dlx1、Msx1的基因和蛋白表达量均增加。沉默Mage-D1后p75NTR、Dlx1、Msx1的基因和蛋白量随之减少。结论:Mage-D1表达于牙胚发育的整个过程,具有时空特异性。Mage-D1正向调控E19.5 d EMSCs的增殖和矿化,负向调控E19.5 d EMSCs的迁移。p75NTR,Dlx1,Msx1似乎在Mage-D1参与矿化调控的潜在机制中发挥作用。
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