水稻分蘖角度控制基因LAZY3的克隆和功能研究

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分蘖角度作为水稻株型的关键决定因素之一,也是决定水稻产量的重要农艺性状。虽然近年来水稻分蘖角度相关研究取得了重要进展,但目前的工作主要还停留在克隆和鉴定分蘖角度控制基因的阶段。这些基因之间的遗传关系尚不清楚,它们介导的分蘖角度的分子调控网络更是知之甚少。因此,克隆新的分蘖角度基因,解析水稻分蘖角度的调控机理,对于改良水稻的株型、培育具有理想株型的新品种具有重要的理论价值和实践意义。  本研究中,我们通过正向和反向遗传学手段筛选到了10个新的水稻散生突变体,命名为lazy3(la3)至la12。我们以la3突变体为重点,进行了深入的研究。表型分析发现la3突变体地上部分重力反应缺陷,其分蘖角度显著大于野生型。我们采用图位克隆法分离了LA3基因,并通过遗传互补实验对LA3调控水稻地上部的重力反应和分蘖角度的功能进行了验证。LA3编码一个叶绿体定位的未知蛋白。LA3蛋白的N末端存在靶向叶绿体的转运肽序列,这些序列对于LA3行使功能是必需的。LA3在水稻幼苗及其基部、叶片、叶鞘以及节间、幼穗等多个器官中都具有较高的表达水平,它对水稻分蘖角度起负调控作用,在转录水平上的表达不受重力刺激的诱导。  我们研究发现,la3突变体幼苗基部叶鞘细胞和幼茎的节间细胞中的淀粉含量及淀粉粒数目显著低于野生型。定量蛋白质组学分析发现,大量与糖代谢相关的酶类表达异常。GO(Gene Ontology,GO)分析结果显示,具有水解酶活性、糖基转移酶、糖基水解酶以及O-糖基化合物水解酶活性的差异蛋白得到富集。此外,la3生长素侧向运输的能力也显著低于野生型。这些结果表明,LA3可能通过调节水稻淀粉代谢来影响水稻地上部分对重力的感应,从而调节重力刺激下的生长素分布,进而控制水稻地上部分的重力反应和分蘖角度。  为了揭示LA3调控水稻淀粉代谢和分蘖角度的机理,我们通过免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)并结合质谱分析(Mass spectrometry,MASS)的方法对LA3的互作蛋白(LA3INTERACTING PROTEINs,LIPs)以及LA3介导的蛋白复合体组分进行了鉴定,进而采用荧光素酶互补实验(Luciferase Complementation,LUC)和BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)的方法对6个LIPs(LIP1至LIP6)蛋白与LA3之间的互作进行了验证。我们从中挑选了LIP1开展了深入的研究。亚细胞定位分析显示,LIP1是一个叶绿体定位的蛋白。我们采用CRISPR-Cas9技术创建了LIP1的基因敲除突变体lip1。测序分析和表型鉴定显示,lip1纯合突变体呈现分蘖角度增大、植株散生生长的特征。此外,统计分析还显示,lip1突变体的分蘖角度与la3单突变体以及la3lip1双突变体的分蘖角度并无显著差异。上述结果表明,LA3可以通过与LIP1互作共同调控水稻分蘖角度,它们在调控水稻分蘖角度方面位于同一个途径中。  为了研究LA3与已知散生基因LA1及LPA1之间的遗传学关系,我们创制了la1la3-1和la3-4lpa1双突变体。遗传学分析表明,LA3在调控分蘖角度方面可能位于LA1的上游,而LA3与LPA1则可能是通过不同的遗传途径调控水稻的分蘖角度。  综上所述,我们克隆了一个控制水稻分蘖角度的新基因LA3,并鉴定到了一个有功能的LA3互作蛋白LIP1。它们可以在叶绿体中发生互作,共同参与调节水稻的淀粉代谢,从而调控水稻地上部分的重力反应和分蘖角度。另外,LA3与LA1在调控分蘖角度方面可能位于同一个遗传途径中。我们的研究不仅丰富了人们对水稻分蘖角度的分子基础的认识,还将为水稻分蘖角度的遗传改良和理想株型育种提供有利的指导。
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