【摘 要】
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目的:放射性肺纤维化进行性发展的关键原因是肌成纤维细胞（Myofibroblast,MFB）凋亡抵抗、持续存在,但MFB发生凋亡抵抗的机制目前尚未明确。细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）是调节、维持细胞功能状态的重要微环境,本研究应用去细胞技术获得肺组织基质,观察放射性肺纤维化中基质重构与MFB凋亡抵抗的相关性及其相关信号通路,并探讨雷公藤内酯醇（Triptolide,
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目的:放射性肺纤维化进行性发展的关键原因是肌成纤维细胞（Myofibroblast,MFB）凋亡抵抗、持续存在,但MFB发生凋亡抵抗的机制目前尚未明确。细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）是调节、维持细胞功能状态的重要微环境,本研究应用去细胞技术获得肺组织基质,观察放射性肺纤维化中基质重构与MFB凋亡抵抗的相关性及其相关信号通路,并探讨雷公藤内酯醇（Triptolide,TPL）对基质重构及MFB凋亡抵抗的影响,为TPL抗放射性肺纤维化应用提供理论基础,同时为放射性纤维化治疗提供新思路。方法:（1）同一批次C57BL/6小鼠全肺用6 MV-X线18 Gy照射诱发放射性肺纤维化;照射小鼠分为照射组（IR组）和照射后TPL给药组（IR+TPL组）,正常未照射小鼠作同龄对照（Normal组）;IR+TPL组给予TPL（0.25 mg/kg）,正常组和IR组给予同剂量的生理盐水,均尾静脉注射一个月。（2）采用非离子洗涤剂与离子洗涤剂结合去细胞技术,制备三组小鼠肺组织去细胞基质。（3）通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）与扫描电镜比较三组肺组织及肺去细胞基质的结构差异。（4）利用肺去细胞基质体外三维培养MFB,分别为NC-matrix组（MFB培养于正常对照组去细胞基质）和IR-matrix组（MFB培养于IR组去细胞基质）,与不借助细胞基质、让MFB直接生长于培养板组（MFB组）一同通过流式细胞术和TUNEL实验观察MFB凋亡水平,并利用蛋白质组学技术分析不同三维培养对MFB细胞蛋白水平及信号通路的差异影响。（5）体外、体内分别采用Western Blotting、免疫荧光双染技术验证蛋白组学结果,并观察TPL对MFB凋亡抵抗及相关信号蛋白的作用。结果:（1）IR组小鼠肺组织结构破坏、基质重构、发生肺纤维化改变;TPL给药可显著缓解放射性肺纤维化。（2）与正常组比较,IR组肺组织中MFB标志蛋白α-SMA表达增加、促凋亡蛋白Bax表达下调,而TPL可下调α-SMA表达、上调Bax水平,显示放射性肺纤维化中MFB存在凋亡抵抗,而TPL可抑制这种现象。（3）经HE染色及扫描电镜观察,制备的去细胞基质保留了放射性肺纤维化基质重构的结构特征。（4）比较二维和三维培养的MFB细胞凋亡率,显示MFB组>NC-matrix组>IR-matrix组,表明照射后的基质重构对MFB细胞具有显著的凋亡抵抗诱导作用。（5）蛋白质组学分析显示重构基质可显著增加基质蛋白、整合素受体的表达,明显上调细胞外基质（ECM）-receptor interaction,并引起下游PI3K-AKT信号通路的活化。（6）Western Blotting结果证实,IR-matrix组基质重构可引起MFB细胞p FAK、p AKT、PI3K蛋白水平上升,Bax蛋白水平下调,TPL则抑制基质重构引起的FAK/PI3K/AKT的活化,上调Bax的蛋白水平。（7）体内免疫荧光双染显示,IR组中MFB（α-SMA+）表达p AKT升高,TPL给药可显著下调p AKT蛋白水平。结论:本研究利用去细胞基质,首次发现放射性肺纤维化中肺组织基质重构是导致MFB凋亡抵抗、持续存在的重要原因。重构基质通过ECM-receptor interaction激活其下游FAK-PI3K-AKT通路,下调Bax蛋白水平,引起MFB凋亡抵抗。同时,首次证实TPL可抑制基质重构诱导的FAK-PI3K-AKT的活化,上调Bax,促进MFB细胞凋亡,从而有效缓解放射性肺纤维化。本研究从基质重构这一新角度,阐释MFB凋亡抵抗、放射性肺纤维化进展的关键机制,并为TPL的抗放射性肺纤维化应用提供理论基础。
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