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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病死率高,常常发生局部侵袭及远处转移是导致其预后不良的主要原因,严重威胁人们生命健康和生活质量。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV )慢性感染与HCC发生密切相关,HBV X基因区编码蛋白(HBx)被认为在HBV相关HCC发生及后期转移过程中发挥关键作用,但其具体机制目前尚未完全阐明,一直是HBV相关肝癌的研究重点。上皮型钙粘蛋白e-cadherin基因在肝癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤中常因表观遗传学机制异常而失活,其表达显著下降或缺失与肿瘤的复发转移密切相关。多梳基因蛋白EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是PRC2沉默复合物(polycomb-repressive complex 2)的重要一员,其介导的组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27mer3)修饰异常导致的基因沉默在肿瘤发生过程中起到重要作用。目前已在前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等多种肿瘤中发现EZH2蛋白表达上调,并可通过H3K27mer3修饰抑制E-cadherin的表达。乙肝病毒HBx蛋白可诱导e-cadherin启动子区DNA甲基化而抑制其表达,进而增加肝癌细胞侵袭转移能力。HBx在肝癌细胞中可否通过EZH2所介导H3K27mer3途径抑制E-cadherin表达目前尚未见报道。因此,阐明HBx协调EZH2介导的H3K27mer3修饰途径与DNA甲基化途径共同参与E-cadherin表达调控机制将会为肝癌的复发转移提供新的诊治手段。本研究中,我们利用构建的HBx稳定表达细胞系AML12-EGFP-HBx研究了HBx通过EZH2介导的H3K27mer3修饰途径和DNA甲基化途径共同调控E-cadherin表达和促进细胞迁移的机制,并在此基础上检测了EZH2作为HBV相关性肝癌治疗靶点的潜在影响。首先,利用脂质体转染在正常小鼠肝细胞系AML12细胞构建了HBx稳定表达细胞系AML12-EGFP-HBx,并检测了EGFP-HBx融合蛋白对CMV启动子活性,PI3K/Akt信号途径和线粒体定位的影响,结果表明EGFP融合并不影响HBx正常生物学功能。然后通过MTT实验、划痕实验和裸鼠成瘤实验分析HBx在AML12细胞的稳定表达对细胞形态变化、增殖能力、迁移能力和裸鼠成瘤能力的影响。结果表明,HBx的表达显著抑制细胞的增殖,未导致正常细胞的恶性转化,但通过改变细胞形态和诱导伪足形成,显著促进细胞运动迁移能力。其次,在上述构建的AML12-EGFP-HBx稳定表达细胞及hbx基因打靶小鼠肝脏组织中,Western Botting检测HBx稳定表达对E-cadherin表达的影响,结果显示HBx在小鼠肝细胞中能够显著抑制E-cadherin的表达。同时,甲基化特异性PCR结果显示HBx能够诱导e-cadherin启动子区DNA高甲基化,表明HBx在小鼠肝细胞中能够通过诱导e-cadherin启动子区DNA高甲基化抑制其表达。已有研究表明,在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤组织中EZH2可通过介导H3K27mer3修饰抑制E-cadherin的表达。我们通过在HepG2细胞中稳定敲低和高表达EZH2,在肝肿瘤细胞中检测了EZH2对E-cadherin是否具有同样的调控作用。Real-time PCR结果显示,敲低ezh2的表达能够显著上调e-cadherin的表达水平,外源高表达ezh2能够显著抑制e-cadherin的表达水平。Western Blotting实验也得到了与此一致的结果,提示在肝相关组织或细胞中EZH2对E-cadherin同样具有调控作用。为研究EZH2在HBx调控E-cadherin表达中的作用,我们在AML12-EGFP-HBx细胞的基础上进一步稳定敲低EZH2表达,划痕实验表明敲低EZH2表达能够减弱HBx对AML12细胞的促迁移作用,Western Blotting结果显示敲低EZH2表达能够显著减弱AML12-EGFP-HBx细胞中HBx对E-cadherin的抑制状态,且不影响e-cadherin启动子区DNA高甲基化状态。进一步利用DNA甲基化酶抑制剂5’-Aza-2’dC处理细胞发现,敲低EZH2能够减弱去除5’-Aza-2’dC后HBx对E-cadherin的重新抑制作用。这些结果表明EZH2可能通过组蛋白甲基化修饰和参与DNA甲基化两种方式在HBx调控E-cadherin表达中发挥重要作用。为确定HBx如何调控EZH2参与抑制E-cadherin表达的分子机制,我们在整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞中检测了HBV复制对EZH2表达水平的影响。结果发现HBV复制能够显著上调EZH2表达和H3K27mer3修饰水平,敲低HBx表达能够消除EZH2的表达上调,提示HBx在调控EZH2表达过程中发挥重要作用。进一步利用瞬时转染实验,证明HBx在HeLa细胞、HepG2细胞和AML12细胞中也能够显著上调EZH2的表达。为进一步阐明HBx上调EZH2表达的分子机制,从AML12细胞和HepG2细胞基因组DNA中分别分节段扩增小鼠和人ezh2基因第一外显子上游约2500bp的调控序列,并构建成ezh2启动子萤光素酶报告载体。萤光素酶活性检测实验表明,HBx通过反式激活ezh2启动子活性上调EZH2蛋白表达水平。在此基础上,对ezh2启动子进行逐步截短并构建相应萤光素酶报告载体,结果发现HBx主要通过-486/-214区域调控ezh2启动子活性。利用TRANSFAC 6.0数据库分析ezh2启动子区发现,在启动子-486/-214区存在典型的转录因子E2F1结合位点,将此位点突变后,HBx对突变体-486/+22M的激活作用显著降低。利用RNAi方法敲低转录因子E2F1的表达后,HBx对ezh2启动子-486/+22区的激活作用明显降低,而对突变体-486/+22M的激活作用则无明显影响,同时HBx对EZH2蛋白的上调作用显著降低。稳定敲低HepG2细胞中E2F1的表达,能够显著抑制EZH2的表达,并继而导致E-cadherin表达的上调。这些结果提示HBx可通过转录因子E2F1反式激活ezh2启动子活性,进而上调EZH2蛋白表达。多项研究发现,EZH2在肝癌中表达显著上调,且与肝癌进展密切相关,我们的结果也表明EZH2在HBx诱导E-cadherin表达下调过程中发挥重要作用,提示EZH2可能作为HBV相关性肝癌的治疗靶点。因此,EZH2对HBV复制的影响是首先要确定的一个问题。我们通过构建可在细胞内自身环化形成类cccDNA样分子的单倍体HBV复制系统,检测了EZH2的表达对HBV复制的影响。结果发现,EZH2介导的H3K27mer3能够结合于HBV cccDNA形成微染色质,高表达EZH2能够显著抑制HBV血清标记物的分泌,以及HBV pgRNA和总RNA的转录。这些结果表明,EZH2可通过组蛋白甲基化修饰调控HBV复制,进而提示我们,在以EZH2为HBV相关性肝癌的治疗靶点时,需要密切监视对HBV复制的影响及可引起HBV重激活的风险。总之,本研究发现HBx可通过激活转录因子E2F1上调EZH2表达,进而通过组蛋白甲基化途径和DNA甲基化途径抑制E-cadherin表达,促进细胞迁移。同时还发现,EZH2可通过组蛋白甲基化修饰调控HBV复制,需要密切注意在以EZH2为HBV相关性肝癌的治疗靶点时对HBV复制的影响。本研究为进一步探讨HBx通过表观遗传学机制调控E-cadherin表达的分子机制,从而为防治肝癌转移提供新的理论基础。