论文部分内容阅读
斜纹夜蛾是鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属的一种害虫。它具有生命周期短、世代重叠、繁殖快、产卵量大、易暴发、食性杂和耐药性强等特点,是危害全球农业的主要害虫。随着人们对食品安全和生态环境的认识,生物防治在斜纹夜蛾的防治中尤为重要。昆虫病原真菌属于昆虫病原微生物重要的一部分,在生物防治上具有重要的利用价值。莱氏绿僵菌是一种具有较高的致病力和侵染能力的昆虫病原真菌,可以寄生于很多种鳞翅目害虫,特别是夜蛾科的害虫。因其对环境友好、主动感染寄主、孢子能形成循环侵染和宿主难以产生抗性等优势,使得莱氏绿僵菌成为是一种应用前景极广,开发潜力极大的生防菌株。但是目前对莱氏绿僵菌致病机制的研究还较少,限制了该菌在斜纹夜蛾等害虫生物防治中的应用。课题组前期鉴定了莱氏绿僵菌分泌到宿主血腔中的蛋白,本研究选择其中的OAA36685为研究对象,分析了它在莱氏绿僵菌感染寄生斜纹夜蛾中的功能,具体实验结果如下:1、基因克隆与序列分析以莱氏绿僵菌cDNA为模板,克隆得到目的基因OAA36685的核酸片段并测序。对该基因进行理化分析得知,其具有一个长度为1896 bp的完整开放阅读框,编码631个氨基酸,蛋白质分子量为71.003 kDa。有信号肽（1-17 aa）,无跨膜结构域。含有一个肽酶超家族M60结构域,推测该蛋白属于金属锌蛋白家族成员。序列比对显示OAA36685与金龟子绿僵菌的通道相关蛋白的相似性最高,为40.28%。2、构建敲除、回补载体与筛选获得突变株构建OAA36685基因敲除载体,通过Linear cassette基因敲除法,将含有OAA36685敲除载体的农杆菌与野生型菌株共培养,筛选得到ΔOAA36685敲除突变株。随后构建OAA36685基因回补载体,将回补载体转入农杆菌后与ΔOAA36685敲除突变株共培养,筛选获得ΔOAA36685cp回补菌株。3、敲除OAA36685基因对真菌生长发育的影响对莱氏绿僵菌野生型菌株、ΔOAA36685突变株和ΔOAA36685cp回补株进行孢子萌发率、生长速率和产孢量的测定,结果显示ΔOAA36685突变株和ΔOAA36685cp回补株与野生型菌株在生长发育上无差异,表明敲除OAA36685基因不会影响莱氏绿僵菌的生长发育,该基因可能与生长发育过程无关。4、敲除OAA36685基因对真菌毒力的影响分别将野生型菌株、ΔOAA36685突变株、ΔOAA36685cp回补株自然感染斜纹夜蛾三龄幼虫和注射感染斜纹夜蛾六龄幼虫,对幼虫死亡数量进行统计,计算半数死亡时间。结果显示自然感染ΔOAA36685突变株的幼虫所需的死亡时间更长,即死亡速率减慢,其半致死时间比野生型组延长14 h;注射感染的结果显示感染ΔOAA36685突变株的幼虫的死亡速率明显低于野生型组和回补株组死亡速率,其半致死时间比野生型组延长4 h。这些结果表明敲除OAA36685基因后,莱氏绿僵菌的毒力下降,该基因与莱氏绿僵菌的毒力有关。5、敲除OAA36685基因对真菌抑制宿主昆虫血细胞延展能力的影响用野生型、ΔOAA36685突变株或ΔOAA36685cp回补株的分生孢子注射感染斜纹夜蛾六龄幼虫,测量浆细胞的长度。结果显示感染ΔOAA36685突变株幼虫的浆细胞的长度明显大于野生型组和回补株组的浆细胞的长度。这一结果表明敲除OAA36685基因后莱氏绿僵菌抑制斜纹夜蛾血细胞延展的能力下降,OAA36685基因在莱氏绿僵菌抑制宿主昆虫细胞免疫方面起着重要的作用。6、敲除OAA36685基因对真菌抑制宿主昆虫酚氧化酶原激活反应能力的影响用野生型、ΔOAA36685突变株、ΔOAA36685cp回补株的分生孢子注射感染斜纹夜蛾六龄幼虫,分别在感染后4个时期取幼虫的血清进行酚氧化酶的活性的测定。结果显示感染ΔOAA36685突变株幼虫的酚氧化酶活性明显高于野生型组和回补株组酚氧化酶活性。这一结果表明敲除OAA36685基因后莱氏绿僵菌抑制斜纹夜蛾酚氧化酶原的激活反应的能力减弱,OAA36685基因在莱氏绿僵菌抑制宿主昆虫体液免疫方面起着重要的作用。7、敲除OAA36685基因对真菌侵染宿主昆虫后在宿主血淋巴中虫菌体数量的影响用野生型、ΔOAA36685突变株、ΔOA36685cp回补株的分生孢子注射感染斜纹夜蛾六龄幼虫,分别在感染后3个时期取幼虫的血清进行虫菌体数量的统计。结果显示感染ΔOAA36685突变株幼虫血腔中虫菌体的数量明显低于野生型组和回补株组虫菌体的数量。这一结果表明敲除OAA36685基因后莱氏绿僵菌在斜纹夜蛾幼虫体内的生长繁殖受到了抑制,这可能是由敲除OAA36685基因后莱氏绿僵菌对宿主昆虫的免疫反应抑制能力降低引起的。综上所述,本研究证实OAA36685具有免疫抑制活性,能抑制宿主昆虫的细胞免疫和酚氧化酶原激活反应。这些结果为我们将来深入研究莱氏绿僵菌侵染宿主昆虫的致病机制打下了基础;同时也为将来通过遗传改良等技术获得毒力更强的莱氏绿僵菌菌株提供了潜在的靶标基因,因此在利用莱氏绿僵菌防治斜纹夜蛾等害虫方面也具有应用价值。