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背景晶状体发育的良好程度决定着眼睛的功能状态,晶状体蛋白质变性而发生浑浊,导致白内障的发生。晶状体的结构由两部分组成,包括前囊区的一层晶状体上皮和由上皮半包裹着的纤维。在晶状体发育过程中,前囊的上皮细胞会在晶状体的赤道区脱核,慢慢向晶状体中心分化成纤维细胞,初级纤维细胞在晶状体的中心排列形成无核和细胞器的区域(organelle-free zone,OFZ),OFZ区保证了晶状体的透明度。热休克转录因子(heat shock transcription factor,HSF)在外界环境或细胞内应激下,编码热休克蛋白的表达,激活热休克反应。HSF通过识别热休克蛋白启动子上的热休克元件调控热休克蛋白的表达。热休克转录因子4(heat shock transcription factor 4,Hsf4)包括Hsf4a和Hsf4b两个剪切本,Hsf4b在晶状体中特异性表达,Hsf4突变会导致家族性先天性白内障的发生,先天遗传或发育障碍的白内障,是一种较常见的儿童眼病,是造成儿童失明和弱视的重要原因。Hsf4是调控晶状体发育的关键转录因子,调控晶状体结构蛋白的表达,晶状体上皮细胞的分化等过程。研究证实,在小鼠和斑马鱼中敲除Hsf4导致白内障的发生。但Hsf4调控晶状体发育过程的具体分子机制还不清楚。细胞骨架参与晶状体的发育过程,对晶状体的分化至关重要。目前已知有三种细胞骨架跟纤维细胞的分化和形态发生有关,包括微管(α/β-Tubulin)、微丝(F-actin)和中间纤维(intermediate filament,IF)。微管主要有α-Tubulin和β-Tubulin两种类型,对于纤维细胞的伸长和囊泡运输至关重要,还在N-钙粘蛋白(N-cadherin)调节细胞与细胞之间的连接中有重要作用。微丝是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝,又称肌动蛋白丝,它是纤维细胞膜重塑的组成部分和机械刚度所必须的,一般作为肌动蛋白网络来调控晶状体的发育。E-钙粘蛋白(E-cadherin)作为上皮细胞中必不可少的黏附系统,与上皮细胞与纤维细胞之间的粘连有关,F-肌动蛋白丝也参与其中。中间纤维在保持晶状体的机械完整性和维持晶状体的透明度方面发挥重要作用。Vimentin是中间纤维的一种,有研究证实Hsf4通过结合在Vimentin的启动子DNA上调控Vimentin的表达来调控晶状体的发育。在前期实验中我们发现Aim-1(absent in melanoma 1,Aim-1)是Hsf4的新下游靶基因,并且Aim-1与F-actin共定位。通过对Aim-1细胞学功能的分析和在晶状体发育过程中分子功能的研究,帮助我们对进一步研究Hsf4调节晶状体发育的分子机制有新的思路。目的本课题以人源晶状体上皮细胞系HLE B3(human lens epithelial cells)、小鼠晶状体上皮细胞系mlec(mouse lens epithelial cells)、小鼠敲除和过表达Hsf4b的晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-和mlec-HA-Hsf4b、野生型C57和Aim-1-/-小鼠为研究对象,对Hsf4新的下游靶基因Aim-1在晶状体发育中的分子功能进行深入研究。方法1.定制识别小鼠Aim-1蛋白的多克隆抗体1号和2号,并表达小鼠全长Aim-1蛋白验证抗体特异性。在人晶状体上皮细胞(HLE B3)过表达带Flag标签的Aim-1蛋白;在小鼠成纤维细胞(MEF)中转染靶向Aim-1的小干扰RNA(si-Aim1),和对照小干扰RNA(si-normal control,si-NC),用Western blot实验检测Aim-1的表达,si-Aim-1的干扰效果及定制抗体1号和2号对Aim-1蛋白识别的特异性。2.利用Western blot实验,在敲除和过表达Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞系mlecHsf4-/-和mlec-HA-Hsf4b中检测Aim-1的表达;同时,在小鼠晶状体上皮细胞系mlec中转染si-Aim-1和si-NC,检测Hsf4下游αB晶状体蛋白(alphaB-crystallin,cryab)的表达。3.在敲除和过表达Hsf4的小鼠细胞系mlec-Hsf4b-/-和mlec-HA-Hsf4b中转染siAim1和si-NC,用实时荧光定量PCR检测Aim-1、cryab、热休克蛋白25(heat shock protein25,Hsp25)和src激酶相关磷蛋白2(src kinase-associated phosphoprotein2,skap2)的mRNA水平表达;在HLE B3细胞系中过表达PEBG-αB-FL和Aim-1各个截短体,用GST-pull down实验检测cryab与Aim-1各个截短体的相互作用。4.在HLE B3细胞中过表达融合GFP的Aim-1各个结构域片段质粒GFP-Aim-1-N-2K、GFP-Aim-1-N-3K、GFP-Aim-1-C-2K和全长质粒3×flag-Aim-1-FL,免疫荧光实验观察Aim-1各个片段和全长在细胞中定位方式;在HLE B3细胞中过表达融合GFP且带有入核序列(NLS)的Aim-1 N端质粒GFP-N-2K-NLS,免疫荧光实验观察带有NLS的Aim-1截短体的定位方式。5.在HLE B3细胞中过表达3×flag-Aim-1-FL质粒,免疫荧光实验标记Aim-1,用鬼笔环肽标记F-actin,观察Aim-1与F-actin的定位方式;在HLE B3细胞中过表达3×flag-Aim-1-FL质粒,免疫荧光实验,标记本底alpha-Tubulin(α-Tubulin),观察Aim-1与α-Tubulin的定位方式。6.在人肾上皮细胞系(293t)中过表达3×flag-cmv7.1和3×flag-Aim-1-FL质粒,Flag抗体进行IP实验检测α-Tubulin和Aim-1的相互作用。7.取5个月野生型(WT)小鼠的眼球,4%多聚甲醛(PFA)固定后脱水、包埋、切片做免疫组化实验,观察Aim-1在晶状体里的定位方式。8.筛选和鉴定用Crispr-cas9技术构建的敲除Aim-1的小鼠模型,提取小鼠肾脏组织total RNA反转录成cDNA,PCR扩增gRNA靶点附近Aim-1 cDNA序列送测序,验证敲除鼠的基因型。9.取6个月和8个月Aim-1敲除小鼠和WT小鼠的眼球,4%PFA固定后脱水、包埋、切片做HE染色,观察敲除Aim-1小鼠和WT小鼠的晶状体表型。结果1.在晶状体上皮细胞中过表达Aim-1全长蛋白,利用siRNA在MEF细胞中敲低Aim-1验证定制的Aim-1多克隆抗体的特异性。结果显示,定制的两个Aim-1多克隆抗体,都能特异性识别Aim-1蛋白。2.Hsf4上调Aim-1,敲低Aim-1后导致Hsf4下游cryab的表达下降,Aim-1与cryab相互作用。3.Aim-1全长定位于细胞胞质中,其肽链中含有NLS序列,具有NLS序列的Aim-1截短体定位于细胞核中。4.Aim-1与α-Tubulin和F-actin在晶状体上皮细胞中部分共定位,与微管蛋白α-Tubulin相互作用。5.Aim-1在野生型成年小鼠晶状体上皮细胞的胞质中定位。6.Aim-1-/-小鼠中Aim-1的2号外显子缺失,导致Aim-1从第214位的亮氨酸移码表达16个不相关氨基酸终止,致使Aim-1全长从1691个氨基酸变成230个氨基酸的截短体,丢失了其12个β/γ结构域和丰富的B型凝集素结构域。7.小鼠中敲除Aim-1可能不影响晶状体早期发育分化过程。结论1.Aim-1全长定位于细胞胞质中且与F-actin共定位。Aim-1也与骨架蛋白α-Tubulin相互作用,其可能为一种细胞骨架蛋白。2.成功构建Aim-1敲除小鼠,但小鼠中敲除Aim-1可能不影响晶状体早期发育分化过程。