基于大豆酶解物锌配合肽的发掘及肽—锌配合作用机理研究

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锌作为人体必需的微量元素,它参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢调节,对维持人体正常生理功能具有至关重要的作用。锌缺乏会导致生长受损、免疫系统缺陷、神经行为错乱等多种继发性疾病。传统的补锌制剂为ZnSO4等无机锌,无机锌在肠道内的不良溶解性使其吸收率低下且对人体具有副作用。蛋白质及天然多肽能与锌离子进行配合作用,形成稳定、可溶的肽-锌配合物。这种肽-锌配合物能有效提高锌在消化系统中的稳定性,增强锌的吸收和生物利用度,可为解决锌缺乏问题提供新的研究思路和理论基础。本文以大豆多肽为研究对象,以锌配合能力为指标,探究不同因素对大豆多肽锌配合能力的影响。从大豆多肽中筛选并分离纯化锌配合肽,对锌配合肽与锌的配合机制及肽-锌配合物的结构和理化特性进行探究。研究结果如下:1、Alcalase酶水解大豆蛋白制备大豆多肽,以锌配合能力为指标,对大豆多肽和锌配合反应进行优化。结果表明,反应温度75℃、反应时间1 h、pH 5.5以及ZnCl2溶液浓度0.45 mmol/L,此条件下大豆多肽跟锌离子的配合能力最强,锌配合能力达26.96±1.22 mg/g。通过紫外光谱和红外光谱表明,大豆多肽中的羧基、氨基和肽键与锌离子结合,从而形成锌配合物。通过荧光光谱、扫描电子显微镜和Zeta电位的结果表明,与锌离子的配合作用改变了多肽的空间结构,使得大豆多肽发生分子内和分子间的折叠与聚集。2、大豆多肽经超滤分离,获得分子量分别为大于5 kDa(F1)、1-5 kDa(F2)、0.5-1 kDa(F3)和小于0.5kDa(F4)四个组分。经测定,四个组分的锌配合能力分别为32.18±2.97 mg/g、43.83±1.25 mg/g、32.08±2.83 mg/g和8.98±0.57 mg/g。其中F2组分的锌配合能力高于其他超滤组分。通过对各超滤组分的氨基酸分析发现,F2组分中具有金属离子配合能力的氨基酸含量(天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)也高于其他超滤组分。将F2组分经分子排阻层析分离,获得三个主要组分,其锌配合能力分别为39.28±4.83 mg/g(F21)、54.28±4.62 mg/g(F22)和36.69±4.23mg/g(F23)。将锌配合能力最高的F22组分经反相高效液相色谱分离,得到三种多肽,其锌配合能力分别为72.47±2.52 mg/g(F221)、39.69±2.56 mg/g(F222)和29.05±1.95mg/g(F223)。对锌离子配合能力最强的多肽进行电喷雾串联质谱分析,确定锌配合肽的分子量为1064.4 Da,氨基酸序列为Lys-Tyr-Lys-Arg-Gln-Arg-Trp(KYKRQRW)。3、对肽-锌配合物进行红外光谱和核磁氢谱分析,结果表明,肽的锌配合位点为色氨酸中羧基的氧和赖氨酸侧链中氨基的氮。与锌离子的配合作用使肽的空间结构发生变化,部分β-折叠转化为无规则卷曲。肽与锌离子的配位亲和力常数为2.63。4、通过热重-热差分析发现,肽-锌配合物的热稳定性比较好,高于锌配合肽,化学键需要更多的热量才能被破坏。肽-锌配合物在酸性条件下,其锌溶解性良好。在pH8.0条件下,肽-锌配合物仍有29.63±4.39%锌溶解率,而ZnSO4的锌溶解率仅为0.89±0.25%。说明肽-锌配合物酸碱稳定性高于ZnSO4。经体外模拟消化,肽-锌配合物的锌溶解率为11.74±2.96%,显著高于ZnSO4的2.31±1.74%,说明肽-锌配合物具有改善锌生物利用度的潜力。
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