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目的:中药复方仙灵骨葆胶囊(XLGB)由补骨脂、续断、淫羊藿、丹参、知母和地黄六味中药组成,主要用于预防和治疗骨质疏松症。课题组前期研究结果显示,XLGB的大鼠含药血浆在体外能够促进前成骨细胞MC3T3-E1细胞的分化和矿化。为进一步发现XLGB入血成分中促成骨细胞分化、矿化的活性成分,并初步揭示其可能的作用机制,我们开展了如下研究。挑选了XLGB的六个代表性入血成分(补骨脂素、新补骨脂异黄酮、淫羊藿苷、木兰花碱、当药苷、川续断皂苷VI)并根据含药血浆浓度配制六个成分组合物,发现组合物能明显的促进MC3T3-E1细胞矿化,而此浓度下的单体却无明显的成骨矿化效应,表明六个成分可能通过协同作用来促进细胞矿化。然而,六个成分的组合物中的活性成分及其潜在的作用机制仍不清楚,因此本研究旨在研究这六个成分组合物中的活性成分并进一步探讨活性成分的潜在机制。方法:1.XLGB入血活性成分的发现。基于XLGB入血成分化学结构及含药血浆浓度,选取了六个代表性成分,并依据其含药血浆浓度配制成组合物。对该组合物进行MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性评价。通过对单体及某成分敲除组合物的系统活性评价,探索各成分对MC3T3-E1细胞分化、矿化的作用,并最终寻找到XLGB入血活性成分。2.XLGB入血活性成分当药苷对MC3T3-E1细胞的影响。对当药苷在0.5μM到10μM的浓度下进行MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性评价。3.当药苷对雌激素受体作用的探讨。利用分子对接方法,预测当药苷与经典雌激素受体(ERs)相互作用,并通过选择性拮抗剂MPP(ER-α拮抗剂)和PHTPP(ER-β拮抗剂)对当药苷促ALP活性的影响进行验证,以及利用ICI 182780(ER拮抗剂)探讨当药苷对雌激素受体表达的影响。4.当药苷在MC3T3-E1细胞内液和外液中的分布研究。利用前期构建的UPLC/TQ-XSMS方法,测定给药不同的时间点下,当药苷在细胞内液和细胞外液中的浓度,进而反映其被MC3T3-E1细胞实际吸收的程度。5.当药苷对雌激素膜受体GPR30的作用研究。评价了当药苷对MC3T3-E1细胞中的GPR30蛋白表达的影响,并利用选择性激动剂G1和拮抗剂G15进行共培养,观察细胞分化以及GPR30蛋白表达的影响。6.当药苷对MAPK信号通路的影响。通过给药1μM当药苷后在不同的时间点进行Western blot,并利用拮抗剂干预进一步验证。结果:1.六个成分(当药苷0.0298μM,补骨脂素0.0269μM,木兰花碱6.2 n M,川续断皂苷VI 0.201 n M,淫羊藿苷3.730 p M,新补骨脂异黄酮0.039 n M)配制的组合物能最大程度的促进MC3T3-E1细胞分化和矿化活性,而六个成分单体各自在对应剂量下均无促进成骨分化、矿化活性。组合物在敲除补骨脂素、当药苷或者木兰花碱后,生物活性不同程度的降低,而当药苷(0.0298μM),补骨脂素(0.0269μM)和木兰花碱(6.2 n M)三者的组合物PMS促成骨分化、矿化活性与六个成分组合物相当,并且组合物PMS敲除任一个成分后,促成骨活性明显降低。2.当药苷能促进MC3T3-E1细胞分化、矿化活性,在1μM浓度时能显著诱导成骨细胞的分化和矿化,其作用与阳性药雌二醇(10 n M)相当。3.分子对接结果表明当药苷和雌激素受体有较高亲和结合力;进一步研究显示,ER-α拮抗剂MPP和ER-β拮抗剂PHTPP均能显著抑制当药苷诱导的ALP活性;此外,当药苷还能促进ER-α表达。4.细胞内液和外液的测定结果显示,当药苷在MC3T3-E1细胞内的浓度仅为2.5 n M,远低于其在细胞外的浓度1μM。5.当药苷能促进成骨细胞中雌激素膜受体GPR30的蛋白表达,并且GPR30拮抗剂G15处理后能明显的抑制当药苷诱导的ALP活性。6.当药苷激活了p38的磷酸化(p-p38),而对细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化的蛋白表达没有明显的激活作用。经p38拮抗剂SB203580处理后,能显著降低当药苷诱导的ALP活性、矿化活性以及p-p38蛋白表达;此外,经G15处理后,也能够抑制p-p38蛋白表达。结论:1.XLGB入血成分补骨脂素、当药苷和木兰花碱是促进成骨细胞分化、矿化的活性成分,它们组成的组合物PMS的活性显著优于各单一成分的骨调节活性,提示其三者间存在协同增效的作用。2.当药苷通过刺激雌激素膜受体GPR30介导的p38信号通路来促进MC3T3-E1细胞分化和矿化活性。此外,当药苷在MC3T3-E1细胞促进分化和矿化过程中,雌激素膜受体GPR30和雌激素受体ER-α存在相互作用,但机制有待进一步研究。