研究目的:温热治疗是指用超出体温的温度作用于病灶部位,参与了很多疾病的治疗或辅助治疗。温热治疗病毒疣已经被写入欧洲病毒疣治疗指南,可以通过调动全身免疫使远隔部位的皮损一同消失,但部分人群对温热治疗呈无反应的状态。因此对温热治疗病毒疣的探究远不应止步,如何提高温热治疗效果,以及改善部分人群对温热治疗无应答状态,是进一步研究的重点。根据温热治疗病毒疣的临床实验观察中可发现,治疗后疣体周围可出现红肿,说明存在局部的炎症反应。既往研究发现44℃温热能显著提升热休克蛋白DNAJA4的表达,敲除该蛋白可能提升温热诱导的皮肤炎症。NLRP3炎症小体在许多皮肤炎症性疾病中发挥作用,而TRPM2（瞬时感受器电位M2）也是温控离子通道,TRPM2的激活有可能通过钙离子内流而进一步激活NLRP3炎症小体信号通路,我们拟从44℃温热诱导角质形成细胞的DNAJA4,TRPM2及NLRP3炎症小体通路方向入手,进一步探究温热治疗病毒疣的潜在机制,为提高温热疗效提供新的思考方向。研究方法:本研究选用两种细胞系进行实验,Ha Ca T细胞系:人永生化角质形成细胞（WT）;DNAJA4缺陷的Ha Ca T细胞（A4KO）。温热方式为44℃水浴细胞30分钟。1、首先利用CCK8及LDH实验检测细胞活性及细胞毒性,用实时定量PCR实验检测NLRP3炎症小体通路相关分子m RNA水平的变化,我们利用酶标仪检测细胞中caspase 1酶的活性,2、为了进一步研究44℃温热在诱导炎症小体通路激活中的作用,我们用PCR及western blot方法检测CRAC通道关键分子,而后通过检测与44℃热干预有关的TRP通道（TRPM2/TRPV1-4）的m RNA的水平,确定了后续实验研究的分子为TRPM2,并用CCK8实验选择TRPM2抑制剂作用于细胞的最佳浓度,用流式细胞仪检测各组细胞焦亡及凋亡比例的情况。3、加入TRPM2抑制剂后,用流式细胞仪检测各组细胞内钙离子浓度及活性氧水平,用PCR技术检测细胞内NLRP3及TRPM2的变化,用免疫荧光实验检测细胞内NLRP3炎症小体表达的平均荧光强度,用ELISA检测细胞分泌的炎症因子的变化。研究结果:1、44℃温热后24h,温热对A4KO的影响与WT相比,细胞活性显著降低,细胞毒性显著升高。实时定量PCR结果显示,温热刺激后12h时,WT和A4KO细胞NLRP3及ASC m RNA的表达量均显著增高。而A4KO较WT细胞在12h时,NLRP3及ASC m RNA的升高程度更加显著,但是caspase 1 m RNA的表达量无显著差异。Caspase 1酶活性实验结果显示,温热可使两种细胞酶活性显著升高,使A4KO组细胞内酶活性升高程度更为显著。2、实时定量PCR检测CRAC通道关键分子STIM1 m RNA发现,温热后6h时,表达量反而降低,而12h及24h时与37℃相比无显著差异。Western Blot实验发现,温热后12h时,Ha Ca T细胞内STIM1与ORAI的蛋白表达水平与37℃相比无显著差异。由于部分TRP通道在44℃时可被激活,用实时定量PCR检测一部分TRP通道m RNA表达情况,发现温热刺激TRPM2表达的趋势与NLRP3相似,后续实验围绕TRPM2展开。用CCK8实验检测TRPM2抑制剂（ACA）浓度梯度变化对细胞活性的影响,在不影响细胞活性且能发挥最大抑制作用的情况下,我们选择20μM浓度的ACA进行后续实验。在温热前1小时加入ACA预刺激细胞,在12h时用流式细胞技术检测细胞凋亡及焦亡的比例,发现温热可使A4KO组细胞焦亡比例显著高于WT组,且ACA可抑制温热诱导的两种细胞的焦亡。3、加入ACA后,用流式细胞技术检测细胞内钙离子浓度及活性氧水平,发现44℃温热可使细胞内活性氧及钙离子浓度升高,并且A4KO组细胞升高差异性更显著;ACA预刺激后显著抑制温热诱导的Ca2+及ROS的升高。ACA显著抑制温热诱导的A4KO细胞NLRP3及TRPM2 m RNA表达水平。细胞免疫荧光实验证明,温热可诱导两种细胞NLRP3表达水平的升高,A4KO组差异更为显著;加入ACA预刺激后,NLRP3表达显著下调。ELISA实验显示温热可刺激IL-1β及IL-18的分泌升高;ACA预刺激后,两种炎症因子的分泌显著下降。研究结论:1、44℃温热诱导角质形成细胞内NLRP3/IL-1β通路的启动;DNAJA4缺陷可显著促进温热诱导的NLRP3炎症小体的启动。2、44℃温热刺激角质形成细胞TRPM2 m RNA的表达,并导致细胞凋亡及细胞焦亡比例升高。相比于野生型,温热诱导DNAJA4缺陷的角质形成细胞TRPM2 m RNA的表达以及细胞死亡比例显著升高。3、温热通过TRPM2/ROS/Ca2+,诱导角质形成细胞的NLRP3炎症小体通路的激活。DNAJA4可抑制温热诱导角质形成细胞内氧化应激及钙离子水平的上调。