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研究背景:哮喘是以气道高反应性、气道炎症和气道重塑为特征的常见慢性气道疾病。对于大多数哮喘患者,糖皮质激素能够较好的控制病情,但慢性气流受限表型对糖皮质激素治疗并不敏感。因此探索哮喘新的作用靶点和治疗药物是仍待解决的问题。谷氨酸-组氨酸-赖氨酸（glycyl-L-histidyl-L-lysine,GHK）是一种人体血液中天然存在的三肽,人体血浆GHK水平随年龄增长而降低。GHK及GHK-Cu参与组织修复和抗炎抗氧化的能力被多项研究证实。在血中与离子铜结合后以GHK-Cu复合物的形式发挥其生物学作用。GHK-Cu的抗氧化性显著强于GHK,并且其多肽粉末更易于保存。之前的一份基于基因表达数据与联通图数据库（Connectivity Map）化合物分析相结合的药物开发报告预测,一些慢性气道疾病（如慢性阻塞性肺疾病）中,GHK水平下降与疾病的发生和疾病严重程度相关。有多项研究证明GHK-Cu对肺部TGF-β1分泌具有明显的抑制作用,且我们先前的研究也已证明给予外源性GHK-Cu可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路介导的EMT来抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。目的:明确哮喘患者血浆GHK水平与疾病严重程度的相关性;明确外源性补充GHK-Cu能否改善OVA诱导的小鼠哮喘模型的气道炎症和气道重塑,并探讨GHK-Cu对小鼠哮喘模型改善作用的相关分子机制。研究方法:本研究分为三个部分,第一部分研究哮喘患者血浆GHK水平和其肺功能的相关性,并使用不同浓度的GHK-Cu干预OVA诱导的小鼠哮喘模型,评估GHK-Cu在小鼠哮喘模型的气道重塑的治疗作用及机制。第二部分研究筛选GHK-Cu的作用靶点并在OVA诱导的小鼠哮喘模型中进行验证。第三部分研究GHK-Cu在OVA诱导的小鼠哮喘气道炎症模型中的治疗作用及机制。1.哮喘患者血浆GHK水平和其肺功能的相关性研究和GHK-Cu在OVA诱导的小鼠哮喘模型的气道重塑的治疗作用及机制研究:1.1支气管舒张试验:评估哮喘患者的肺功能。1.2高效液相色谱法:评估哮喘患者的血浆GHK水平。1.3实验动物分组和小鼠哮喘模型的制备:将6-8周龄的BALB/c野生型雌性小鼠以随机数字表法随机分为4组（n=6）,即对照组（CON组）,模型组（OVA组）,低剂量GHK-Cu（OVA+0.2mg/kg GHK-Cu）组（L-GHK-Cu组）,高剂量GHK-Cu组（OVA+20mg/kg GHK-Cu）组（H-GHK-Cu组）。除对照组外的其他组在第0天和第14天给予腹腔注射2ml OVA致敏液进行致敏,对照组以腹腔注射等量的生理盐水作为代替。从第24天起,模型组和低、中剂量GHK组连续18天每天给予OVA激发液经气道雾化吸入,每天一次,每次激发30分钟;在每次雾化吸入OVA激发液前1h,GHK-Cu组给予相应剂量的GHK-Cu治疗液腹腔注射给药,模型组给予等量生理盐水腹腔注射。对照组则在相应时间点应用等量生理盐水代替给予雾化激发和给药。1.4肺功能激发实验:在末次激发后48-24h内,使用梯度浓度的氯化乙酰甲胆碱溶液进行小鼠支气管激发试验诱导气道高反应,使用全身体积描记法进行小动物无创肺功能评估。使用Pehn评估小鼠气道阻力的变化。1.5肺组织石蜡切片制备与染色:收集小鼠左肺,石蜡包埋并切片。对肺组织切片进行HE染色以评估气道周围炎症细胞浸润情况;对肺组织切片进行PAS染色以评估小气道上皮杯状细胞化生情况;对肺组织切片进行Masson染色以评估小气道上皮下纤维化情况。1.6支气管肺泡灌洗液细胞（BALF）总数计数与分类计数:收集小鼠BALF沉淀细胞,重悬后进行细胞计数和姬姆萨染色,统计小鼠的BALF细胞总数和嗜酸细胞计数。1.7免疫组织化学技术染色:对小鼠肺组织切片进行免疫组化染色,评估小鼠上皮-间质（EMT）现象相关蛋白（α-SMA、E-Cadherin和Vimentin）和TGF-β1蛋白表达情况。1.8 Western Blot:提取小鼠肺组织蛋白,评估小鼠肺组织TGF-β1、smad3和p-Smad3蛋白表达水平。2.筛选GHK-Cu的作用靶点并在OVA诱导的小鼠哮喘模型中进行验证:2.1蛋白质互相作用分析:基于生物信息数据库,筛选出GHK对应的靶蛋白,并制作蛋白质互相作用网络,选择GHK的核心靶点。2.2分子对接:计算选择出的核心靶点能否与GHK-Cu直接结合。2.3实验动物分组和哮喘小鼠气道重塑模型的制备:将6-8周龄的BALB/c野生型雌性小鼠以随机数字表法随机分为4组（n=6）,即对照组（CON组）,模型组（OVA组）,高剂量GHK-Cu组（OVA+20mg/kg GHK-Cu）组（GHK-Cu组）,SIRT1抑制剂（OVA+20mg/kg GHK-Cu+5mg/kg EX-527）组（EX-527组）。EX-527组给予20mg/kg GHK-Cu治疗液和5mg/kg EX-527腹腔注射给药。造模方法与第一部分相同。2.4细胞处理和分组:将人支气管上皮样细胞（16HBE）常规传代培养,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,在5%CO2,37℃的培养条件下进行培养。分为空白组（GHK-Cu-/HDM-）,GHK-Cu对照组（10μm GHK-Cu+/HDM-）,HDM组（GHK-Cu-/HDM+）,低剂量GHK组（5μm GHK-Cu+/HDM+）,高剂量GHK-Cu组（10μm GHK-Cu+/HDM+）。分别给予对应的HDM和（或）GHK-Cu刺激16HBE细胞。2.5 SIRT1去乙酰酶活性测定:提取各组细胞蛋白,测定细胞内的SIRT1去乙酰酶活性。2.6肺组织石蜡切片制备与Masson染色:收集小鼠左肺,石蜡包埋并切片。对肺组织切片进行Masson染色以评估小气道上皮下纤维化情况。2.7免疫荧光:检测小鼠气道上皮的SIRT1表达情况。2.8免疫组织化学:评估各组小鼠上皮-间质（EMT）现象相关蛋白（α-SMA）的表达情况。2.9 Western Blot:提取小鼠肺组织蛋白,评估小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达水平3.GHK-Cu在OVA诱导的小鼠气道炎症模型中的治疗作用及机制研究:3.1实验动物分组和哮喘小鼠气道炎症模型的制备:将6-8周龄的BALB/c野生型雌性小鼠以随机数字表法随机分为4组（n=6）,即对照组（NS组）,模型组（OVA组）,低剂量GHK-Cu（OVA+0.2mg/kg GHK-Cu）组（L-GHK-Cu组）,高剂量GHK-Cu组（OVA+20mg/kg GHK-Cu）组（H-GHK-Cu组）,地塞米松（2mg/kg）治疗组（DEXA组）。除对照组外的其他组在第0天,第7天和第14天给予腹腔注射2ml OVA致敏液进行致敏,对照组以腹腔注射等量的生理盐水作为代替。从第21天起,模型组和低、高剂量GHK组和地塞米松治疗组连续4天每天给予5%OVA溶液液经气道雾化吸入,每天一次,每次激发30分钟;在每次雾化吸入OVA激发液前1h,GHK-Cu组给予相应剂量的GHK-Cu治疗液腹腔注射给药,地塞米松治疗组给予2mg/kg地塞米松溶液腹腔注射给药,模型组给予等量生理盐水腹腔注射。对照组则在相应时间点应用等量生理盐水代替给予雾化激发和给药。3.2肺功能激发实验:在末次激发后48-24h内,使用梯度浓度的氯化乙酰甲胆碱溶液进行小鼠支气管激发试验诱导气道高反应,使用全身体积描记法进行小动物无创肺功能评估。使用Pehn评估小鼠气道阻力的变化。3.3肺组织石蜡切片制备与染色:集小鼠左肺,石蜡包埋并切片。对肺组织切片进行HE染色以评估气道周围炎症细胞浸润情况;对肺组织切片进行PAS染色以评估小气道上皮杯状细胞化生情况。3.4支气管肺泡灌洗液细胞总数计数与分类计数:收集小鼠BALF沉淀细胞,重悬后进行细胞计数和姬姆萨染色,统计小鼠的BALF细胞总数和嗜酸细胞计数。3.5 ELISA:收集小鼠BALF上清,评估BALF中的IL-4、IL-13和TNF-α水平。3.6 MDA含量检测:收集小鼠BALF上清,评估BALF中的MDA水平。3.7 Western Blot:提取肺组织蛋白,评估肺组织内Akt、P38、p-Akt和p-P38蛋白表达情况。研究结果:1.哮喘患者血浆GHK水平和其肺功能的相关性研究和GHK-Cu在OVA诱导的小鼠哮喘模型的气道重塑的治疗作用及机制研究:1.1舒张前FEV1和舒张后FEV1都与血浆GHK水平存在中等程度的正相关（r=0.566,p=0.011;r=0.530,p=0.020）。舒张前MMEF75/25也与血浆GHK水平存在中等程度的正相关（r=0.549,p=0.015）。1.2当雾化氯化乙酰甲胆碱浓度为50mg/ml时,低剂量GHK-Cu组和高剂量GHK-Cu组的Pehn都显著地低于OVA组。1.3相比于OVA组,给予低剂量和高剂量GHK-Cu干预后小鼠气道周围炎性细胞浸润明显减少,炎症评分均有明显降低。1.4低剂量和高剂量GHK-Cu组的小鼠BALF中的炎症细胞总数相比OVA组均有明显降低,嗜酸性粒细胞数相比OVA组均有明显降低。1.5低剂量和高剂量GHK-Cu组的小鼠小气道黏液分泌和杯状细胞化生相比OVA组均有明显降低。1.6低剂量和高剂量GHK-Cu组的小鼠气道周围的胶原沉积明相比OVA组均有明显降低。1.7相比于OVA组,高剂量GHK-Cu组的小鼠气道周围的间质蛋白指标α-SMA和Vimentin均有明显下调,其气道上皮细胞连接蛋白E-Cadherin也显示出了明显的上调。这表明高剂量GHK-Cu可抑制哮喘小鼠气道的EMT现象。1.8肺组织免疫组化染色结果显示,相比于对照组,OVA组气道周围的TGF-β1表达增多。1.9 Western Blot结果显示,相比于OVA组,给予高剂量GHK-Cu干预的哮喘小鼠TGF-β1表达水平下调,Smad3表达水平没有明显变化,而Smad3的磷酸化水平明显下调。这表明高剂量GHK-Cu明显抑制哮喘小鼠的TGF-β1/smad3信号通路。2.筛选GHK-Cu的作用靶点并在OVA诱导的小鼠哮喘模型中进行验证:2.1蛋白质互相作用网络结果显示GHK的作用靶点为血管紧张素Ⅱ-1型受体（AngiotensinⅡtype1 receptor,AGTR1）,肾上腺素能β受体激酶1（adrenergic beta receptor kinase 1,ADRBK1）,沉默信息调节因子1（sirtuin-1,SIRT1）。通过查阅哮喘相关文献,选取SIRT1进行后续分析与验证。2.2分子对接的模拟结果显示,GHK-Cu可以与SIRT1直接结合形成蛋白质复合物,复合物的交互位点由GLU-416、GLU-410、LYS-377和THR-368组成。2.3 HDM处理降低了16HBE细胞的SIRT1水平（p＜0.01）,而GHK-Cu以浓度依赖性方式回调了经HDM刺激的16HBE细胞的SIRT1水平。2.4 SIRT1去乙酰酶活性检测结果显示OVA抑制了16HBE细胞的SIRT1去乙酰酶活性,在经HDM刺激的细胞中GHK-Cu剂量依赖性地上调SIRT1脱乙酰酶活性。2.5免疫荧光结果显示,给予GHK-Cu干预可以上调经OVA诱导的哮喘小鼠的SIRT1水平。2.6 GHK-Cu组的小鼠气道周围的胶原沉积面积相比OVA组明显降低,GHK-Cu的这种改善作用被额外给予的EX-527所抵消。2.7免疫组化染色结果显示,GHK-Cu组的小鼠气道上皮下α-SMA表达相比OVA组明显降低,GHK-Cu的这种下调作用被额外给予的EX-527所抵消。2.8 Western Blot结果显示,相比于OVA组,GHK-Cu干预抑制小鼠肺组织TGF-β1表达,GHK-Cu的抑制作用被额外给予的EX-527所抵消。3.GHK-Cu在OVA诱导的小鼠哮喘模型的气道炎症的治疗作用及机制研究:3.1当雾化氯化乙酰甲胆碱浓度为50mg/ml时,低剂量GHK-Cu组和高剂量GHK-Cu组的Pehn都显著地低于OVA组,并且高剂量GHK-Cu对气道高反应的改善效果与地塞米松组相似。3.2相比于OVA组,高剂量GHK-Cu组的小鼠杯状细胞化生明显减少。3.3相比于OVA组,给予低剂量和高剂量GHK-Cu干预后小鼠气道周围炎性细胞浸润明显减少,炎症评分均有明显降低,并且高剂量GHK-Cu的治疗效果与地塞米松组无统计学差异。3.4相比于OVA组,高剂量GHK-Cu组的小鼠BALF中的炎症细胞总数明显降低,嗜酸性粒细胞数也明显降低。高剂量GHK-Cu组与地塞米松组的BALF炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞数无统计学差异。3.5 ELISA结果显示,相比于OVA组,给予低剂量和高剂量的GHK-Cu干预均可以降低哮喘小鼠BALF中的IL-4、IL-13和TNF-α水平。3.6与OVA组相比,给予低剂量和高剂量的GHK-Cu干预均可以降低BALF的MDA含量。3.7 Western Blot结果显示,相比于OVA组,低剂量和高剂量GHK-Cu组哮喘小鼠的肺组织Akt和P38的磷酸化水平均明显下调。研究结论:1.哮喘患者的血浆GHK水平与肺功能指标相关。2.GHK-Cu可以改善哮喘小鼠的气道炎症和气道重塑。3.GHK-Cu通过下调Akt/MAPK通路抑制小鼠气道氧化应激水平,从而改善哮喘小鼠的气道炎症。4.GHK-Cu上调小鼠气道上皮细胞的SIRT1表达水平,并且与SIRT1直接结合并激活其活性。5.GHK-Cu通过上调小鼠气道上皮细胞的SIRT1表达水平并激活SIRT1,以下调TGF-β1/Smad通路抑制小鼠气道上皮-间质转化（EMT）现象,从而改善哮喘小鼠的气道重塑。