目的:支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见且严重的呼吸系统并发症,以肺泡发育停滞为主要特征。其病死率高,即使存活也会伴有远期的肺通气、换气及肺泡弥散功能障碍,严重影响患儿的生存质量。但目前尚无有效的治疗手段。Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）作为肺泡上皮细胞的“祖细胞”,当肺上皮受损时,不仅可以自我更新,还能增殖并分化为I型肺泡上皮细胞（AEC I）,在肺泡结构和功能的修复中起着重要的作用。大量研究证实氧化应激是BPD疾病发生发展中的关键环节,但与BPD结局的关系目前尚不明确。DNA损伤是氧化应激的最严重表现形式,其能否修复关乎到细胞的生存及结局,其中DSB双链断裂（DSBs）是DNA损伤最严重的类型,若修复失败则可引发细胞永久性的生长停滞。因此,为了探索BPD肺上皮细胞DNA损伤的病理机制,本研究分别从动物水平、原代细胞水平以及体外细胞高氧暴露试验,应用ELISA、免疫荧光、Western-blot、彗星实验等实验方法,检测BPD大鼠肺组织及AECⅡ中DNA损伤标志物8-ohdG和γ-H2AX的表达变化,以及DNA丝条断裂情况,并在此基础上,利用基因芯片技术,筛选并验证DNA损伤修复信号通路的差异表达基因,并通过细胞转染技术验证是否能够通过改变该差异基因表达水平,来促进AECⅡ细胞DNA损伤的修复,进而减轻的DNA损伤,促进细胞增殖及生存,意图为BPD生物学标记物提供理论依据,更为BPD的临床治疗提供新的干预靶点。研究方法:第一部分:检测BPD大鼠肺组织及AECⅡ中DNA损伤标志物的表达。1.构建BPD动物模型,将新生SD大鼠随机分为模型组（FiO2=0.85）和对照组（FiO2=0.21）,分别于生后1d、3d、7d和14d,每组随机取8只收集肺组织标本,进行后续实验:（1）应用H&E染色观察肺组织形态学改变,RAC值评估肺发育;（2）应用ELISA方法检测肺组织内8-ohdG的含量;（3）应用免疫荧光方法观察肺组织中γ-H2AX的定位及表达;（4）应用Western-blot检测肺组织中γ-H2AX的表达;（5）应用免疫荧光双标观察肺组织中γ-H2AX与AECⅡ标志物p180共表达;2.构建BPD动物模型,分别于生后3d、7d和14d,每组随机取8只提取原代AECⅡ,并应用Western-blot检测γ-H2AX的表达;3.构建体外高氧暴露细胞模型,将RLE-6TN细胞系传代后随机分为模型组（FiO2=0.85）和对照组（FiO2=0.21）,分别于12h、24h和48h收集细胞,进行后续实验:（1）显微镜下观察细胞状态;（2）应用免疫荧光观察细胞中γ-H2AX的定位及表达;（3）应用Western-blot检测细胞中γ-H2AX的表达水平;（4）应用彗星实验观察细胞的DNA丝条断裂情况。第二部分:筛选并验证BPD大鼠DNA损伤信号通路的差异表达基因。1.构建BPD动物模型,随机选取模型组及对照组日龄14d大鼠各3只,并提取肺组织作为样本进行后续芯片实验;2.应用基因芯片技术,筛选BPD大鼠肺组织中DNA损伤信号通路中的差异表达基因;3.应用Real-time PCR和Western-blot技术对差异基因进行验证。第三部分:观察过表达/沉默rad1后AECⅡ细胞DSB损伤及细胞增殖的情况。1.建立过表达及沉默Rad1的RLE-6TN细胞系,并将细胞分为5组:（1）对照组:细胞置于普通细胞培养箱中（FiO2=0.21）培养48h;（2）单纯高氧组:细胞置于高氧细胞培养箱（FiO2=0.85）培养48h;（3）空载组:空载体转染细胞后置于高氧细胞培养箱（FiO2=0.85）培养48h;（4）沉默组:siRNA-Rad1干扰细胞后置于高氧细胞培养箱（FiO2=0.85）培养48h;（5）过表达组:过表达Rad1载体转染细胞后置于高氧细胞培养箱（FiO2=0.85）培养48h,进行后续实验;2.应用免疫荧光观察每组细胞中γ-H2AX的定位及表达;3.应用Western-blot技术检测每组细胞中γ-H2AX的表达;4.应用彗星实验检测每组细胞的DNA丝条断裂情况;5.应用Western-blot技术检测每组细胞的细胞周期调控蛋白p21的表达;6.应用流式细胞术检测每组细胞的细胞周期情况;7.应用克隆形成实验观察每组细胞的增殖及生存情况。结果:第一部分:1.肺组织形态学改变:1)H&E结果显示,模型组1d和3d时肺组织形态与对照组无明显区别。7d时肺组织差异开始明显,表现为肺泡数量明显减少,形态不规则,肺泡嵴及刺激间隔均不明显,至14d时肺泡数目更加减少,体积进一步增大,且大小不均,形态不规则,肺泡结构简单化;2)RAC值结果显示,模型组和对照组在1d和3d时RAC值无明显差异。与对照组相比,模型组的RAC值从7d开始下降,差异有统计学意义（P<0.05）,在14d时差异更加显著（P<0.01）。2.肺组织中DNA损伤标志物8-OHdG和γ-H2AX的表达:1)ELISA结果显示,与对照组相比,模型组的8-OHdG含量从3天开始升高,差异有统计学意义（P>0.05）,7d、14d时差异更加显著（P<0.01）;2)免疫荧光结果显示,γ-H2AX主要表达于细胞核,并且放大后清晰可见星星点点的γ-H2AX焦点聚集在细胞核内。与对照组相比,模型组γ-H2AX阳性细胞数从3d开始增加,7d和14d时差异更加明显;3)Western-blot结果显示,与对照组相比,模型组的γ-H2AX表达水平从3d开始增加,7d时明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,14d时差异更加显著（P<0.01）。3.肺AECⅡ中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达:1)免疫荧光双染结果显示,γ-H2AX表达于细胞核中,p180表达于细胞浆内。模型组14d肺组织中γ-H2AX/P180双染细胞占P180阳性细胞百分比显著高于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;2)不同日龄大鼠原代AECⅡ的Western-blot结果显示,与对照组相比,模型组原代AECⅡ的γ-H2AX表达水平从3d开始增加,7d时明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,14d时差异更加显著（P<0.01）。4.体外高氧暴露细胞模型中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达及DNA丝条断裂情况:1)细胞培养结果显示,对照组细胞生长良好,且随着培养时间的延长,细胞数不断增多。相比对照组,模型组12h时即出现细胞数量减低,细胞状态变差,24h和48h时细胞数量减少更加显著,细胞状态变得更差;2)免疫荧光结果显示,γ-H2AX表达于细胞核中。对照组γ-H2AX表达较少。模型组γ-H2AX的表达从12h开始增加,24h和48h时增加的更明显;3)Western-blot结果显示相比对照组,模型组γ-H2AX的表达水平从12h开始增加,差异有统计学意义（P<0.05）,24h和48h时差异更加显著（P<0.01）;4)彗星实验结果显示,对照组只有极少量细胞的DNA发生迁移,未见明显改变;模型组12h即可见DNA从细胞核显著迁移,形成“彗星尾”,并随着时间的延长,“彗星尾”更加明显。与对照组相比,模型组尾长和Olive尾矩从12h开始升高,差异有统计学意义（P<0.01）,且随着时间的延长,差异更加显著,48h差异最大（P<0.01）。根据彗星尾部DNA含量对细胞DNA损伤程度进行分级,结果显示:对照组彗星尾部DNA含量百分比无显著变化,损伤程度均为0级;模型组彗星尾部DNA含量百分比从12h开始增加,差异有统计学意义（P<0.01）,损伤程度增加到2级,24h和48h时,彗星尾部DNA含量百分比增加更明显,损伤程度均达到3级。第二部分:1.差异表达基因:RT-qPCR芯片筛查结果显示,以P<0.05,差异倍数>1.5为标准,两组肺组织中DNA损伤信号通路差异表达基因共19个,其中模型组高表达的基因有8个,分别是Brca1、Cdc25c、Cdkn1a（p21）、Dclre1a、Fanca、Fancd2、Gadd45g和Mgmt。低表达基因11个,分别是Ddit3、Fancc、Mbd4、Msh3、Nthl1、Pms1Ppm1d、Rad1、Rad52、Smc3和Wrn;2.验证上调基因Cdc25c和Cdkn1a:Real-time PCR及Western-blot结果显示,相比对照组,模型组Cdc25c和Cdkn1a的mRNA和蛋白水平均显著升高（P<0.01）,与芯片结果相一致;3.两组14d大鼠原代AECⅡ的细胞周期情况:细胞周期结果显示,模型组原代AECⅡ的G0/G1期比例显著增加（P<0.01）,S期比例显著减少（P<0.01）,细胞增殖缓慢;4.验证下调基因Rad1,Rad52和Smc3:PCR结果显示,相比对照组,模型组肺组织中Rad1,Rad52和Smc3的mRNA水平明显低于对照组（P<0.01）,与芯片结果相一致。Western-blot结果显示模型组肺组织中Rad1和Smc3的蛋白水平明显低于对照组（P<0.01）,与芯片结果相一致。但Rad52的蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）,与mRNA水平不一致。第三部分:1.五组细胞中γ-H2AX的表达:1)免疫荧光结果显示:对照组中γ-H2AX荧光强度很弱,表达量很低;单纯高氧组及空载组内γ-H2AX焦点荧光强度及数量显著增加;相比空载组,过表达组γ-H2AX荧光强度及表达量显著降低,而沉默组γ-H2AX的表达水平显著增加;2)Western-blot结果显示,相比对照组,单纯高氧组及空载组细胞内γ-H2AX的表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）。相比空载组,过表达组细胞内γ-H2AX的表达水平显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）;而沉默组γ-H2AX的表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）。2.五组细胞的DNA丝条断裂情况:彗星实验结果显示,对照组中细胞无彗尾,损伤程度为0级,单纯高氧组及空载组,细胞有明显彗尾,彗尾长度、Olive尾矩及彗星尾部DNA含量明显高于对照组（分别为P<0.01,P<0.05和P<0.01）,细胞损伤程度为3级;相比空载组,过表达组细胞彗尾显著缩短,彗尾长度、Olive尾矩及彗星尾部DNA含量显著降低,差异有统计学意义（分别为P<0.01,P<0.05和P<0.05）,细胞损伤程度显著减轻,变为2级;沉默组细胞彗尾显著变长,彗尾长度、Olive尾矩及彗星尾部DNA含量显著增加,差异有统计学意义（分别为P<0.05,P<0.01和P<0.01）,细胞损伤程度加重,为3级。3.五组细胞周期蛋白的表达及细胞周期的改变:1)Western-blot结果显示,相比对照组,单纯高氧组及空载组细胞内p21的表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）;相比空载组,过表达组细胞内p21的表达水平显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）;而沉默组p21的表达水平显著升高（P<0.01）;2)细胞周期结果显示:相比对照组,单纯高氧组及空载组细胞G0/G1期比例显著增加（P<0.01）,S期的比例显著降低（P<0.01）,细胞周期受阻,细胞增殖受到抑制;相比空载组,过表达组细胞G0/G1期比例显著减少（P<0.01）,S期比例显著增加（P<0.01）,细胞周期阻滞减轻,细胞增殖改善;而沉默组细胞G0/G1期比例显著增加（P<0.01）,S期比例显著减少（P<0.05）,细胞周期阻滞加重,细胞增殖抑制。4.五组细胞增殖及生存情况:克隆形成实验结果显示:对照组细胞形成克隆能力较强。与对照组相比,单纯高氧组及空载组细胞形成能力显著减弱,克隆形成率显著降低（P<0.01）。与空载组相比,过表达组细胞克隆形成能力显著增强,克隆形成率显著增加（P<0.01）;沉默组细胞克隆形成能力显著减弱,克隆形成率显著降低（P<0.01）。结论:1.BPD大鼠肺组织及AECⅡ中DNA损伤标志物表达增加,且随着日龄的增长增加愈加显著,提示不断累积的DNA损伤可能是导致BPD肺泡发育停滞的重要原因,并为临床BPD的血清生物学标记物提供理论基础;2.基因芯片筛选并验证了DSB重要修复因子Rad1的表达下调,提示Rad1的表达下调抑制AECⅡ的DSB损伤修复导致损伤不断累积可能是BPD中AECⅡ细胞周期阻滞及细胞增殖抑制的关键环节;3.Rad1的表达上调能够促进AECⅡ的DSB损伤修复,减轻细胞DNA损伤,改善细胞周期阻滞,增强细胞的增殖及存活,为未来BPD的临床治疗提供新的干预靶点。