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目的新辅助化疗,又称术前化疗,是指在恶性肿瘤实施手术或放疗前应用的全身性化疗,它具有缩小肿瘤体积、消除远处微小转移灶、降低肿瘤分期、为部分病人创造保乳手术机会等优点。病理学完全缓解是指接受新辅助化疗后乳腺组织和淋巴结内没有原位癌和浸润性癌残留,它可以作为预测病人预后的一个指标。但是,部分病人在接受新辅助化疗后并不能获得病理学完全缓解,因此寻找到能够预测新辅助化疗反应性的分子标记物就迫在眉睫。MicroRNA是一类小的非编码RNA,它能够通过对靶基因的转录后调控从而参与到一系列的生理和病理活动中去。本研究旨在评估新辅助化疗前粗针穿刺标本中的microRNA表达谱和病人对蒽环类和紫杉类为基础的新辅助化疗反应性之间的相关性。我们这部分研究的理论依据是建立在这样的基础上的--治疗前的microRNA表达谱包含有治疗反应性的信息,这些信息能够被用来预测患者的临床预后。内分泌治疗是激素受体阳性乳腺癌最重要的治疗方法,然而它的有效性却受制于耐药的出现,并且耐药的出现最终导致了疾病的进展和患者的死亡。在过去的几十年中,尽管许多研究已经对耐药的分子机制给出解释,但目前仍未阐明其确切机制。其中雌激素受体α(ERα)的表达下调和人表皮生长因子受体2(HER-2/ErbB2)的过表达是导致乳腺癌患者内分泌耐药的两个重要原因。本研究旨在分析人造血相关的PBX相互作用蛋白(HPIP)在乳腺组织中的表达情况,并初步探讨其与乳腺癌患者预后及各临床病理学参数之间的相关性,进一步阐述其与内分泌治疗耐药的关系。方法将接受至少4轮系统性新辅助化疗的病人分为2组:病理学完全缓解(pCR)组和非病理学完全缓解组(non-pCR),这些患者的粗针穿刺标本将用于进一步的分析。所有病人在粗针穿刺前均未接受任何形式的放疗、化疗和内分泌治疗。首先,我们运用miRNA TaqMan Low-density Arrays(TLDA)的方法评估了样本中的microRNA表达谱并筛选出差异表达的microRNA。随后通过转染的方式评估了差异表达的microRNA的表达水平对乳腺癌细胞(MCF7或BT549)对化疗药物(紫杉醇+表阿霉素)敏感性的影响。最后通过预测miR-125b和miR-141的靶基因,进一步阐明它们如何参与调节乳腺癌细胞对新辅助化疗敏感性。选取了2003年至2007年之间,天津市肿瘤医院乳腺病理研究室诊断的306例原发性浸润性乳腺癌,通过免疫组化染色方法检测了肿瘤组织内HPIP蛋白的表达,分析了其与预后(无病生存和总生存)以及各临床病理学参数之间的相关性。另外通过免疫组化染色的方法分析了 208例乳腺癌组织和癌旁的正常组织的HPIP的表达差异。结果1.通过生物信息学的方法—聚类分析,我们发现总的microRNA表达在获得病理学完全缓解组和没有获得病理学完全缓解组之间没有差异,但同时我们也发现miR-125b和miR-141在没有获得病理学完全缓解组的表达出现上调(miR-125,P=0.010;miR-141,P=0.016)。2.体外细胞学实验证实:miR-125b和miR-141的上调导致了乳腺癌细胞MCF7和BT549对化疗药物(紫杉醇+表阿霉素)的敏感性降低(MCF7,P<0.001;BT549,P<0.001)。3.miR-125b和miR-141表达水平的下调增加了乳腺癌细胞MCF7和BT549对化疗药物(紫杉醇+表阿霉素)的敏感性(MCF7,P=0.015;BT549,P=0.017)。4.运用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库和TargetScan软件,我们分别预测了调控miR-125b和miR-141产生的上游因子和下游靶基因。ATM是miR-125b产生的上游调节因子并且miR-125b的绝大多数的下游靶基因都参与了对细胞凋亡通路和细胞周期的调节。miR-141的上调很有可能是由于激活的DNA损伤修复通路产生的应激诱导的衰老所诱发的。但是miR-141的下游靶基因和细胞增殖和凋亡通路有关系而和DNA损伤反应途径之间没有直接关系。5.208例配对的肿瘤组织和癌旁正常组织免疫组化染色结果显示:乳腺癌组织的HPIP的表达要明显高于癌旁的正常组织(P=4.66 × 10-28)。6.肿瘤细胞的HPIP的表达与多个临床病理学特征之间存在相关性,如与雌激素受体α(ERα)(P=0.008)的表达呈负相关与人表皮生长因子受体2(HER-2/ErbB2)(P=0.002)的表达呈正相关。7.HPIP的高表达与患者的无病生存时间(P=0.012)和总生存时间(P=0.002)呈负相关。8.Cox单因素回归模型分析发现HPIP的表达可以作为患者无病生存(P=0.014)和总生存(P=0.003)的预后指标。Cox多因素回归模型分析发现HPIP的表达可以作为患者无病生存(P=0.02)和总生存(P=0.003)的独立预后指标。9.在306例乳腺癌患者中有199例接受了他莫昔芬的治疗,107例未接受他莫昔芬治疗。对于接受他莫昔芬治疗的乳腺癌患者,HPIP高表达的患者无病生存和总生存时间要比低表达的患者短(DFS:P=0.006;OS:P=0.002)。然而,对于没有接受他莫昔芬治疗的乳腺癌患者,HPIP的表达水平与患者的无病生存时间和总生存时间无关(DFS:P=0.593;OS:P=0.224)。这些结果强烈提示HPIP可能调节乳腺癌对内分泌治疗药物他莫昔芬的反应性。结论和获得病理学完全缓解的患者相比,miR-125b和miR-141在没有获得病理学完全缓解组的表达出现上调。我们推测这可能与miR-125b和miR-141能够调节乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性有关。于是我们通过一系列的体外细胞学实验(例如CCK-8实验)去验证这个假设。KEGG信号通路分析提示:DNA损伤修复通路的激活诱导了 miR-125b和miR-141的产生。Targetscan分析所获得的靶基因提示miR-125b可能通过介导凋亡抵抗和DNA损伤修复参与化疗耐药。综上所述,这些结果初步阐明了 miR-125b和miR-141的高表达能够预测以蒽环类和紫杉类药物为基础的新辅助化疗患者的临床反应性。HPIP的表达可以作为乳腺癌患者的独立预后因素,因此HPIP有望作为乳腺癌治疗的新靶点。HPIP可能通过抑制ERα的表达,上调HER-2的表达参与到乳腺癌对内分泌治疗药物他莫昔芬的耐药,因此它可以为内分泌耐药提供新的理论基础。