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目的:1.研究miR-4306对食管癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移和凋亡的影响。2.初步探讨miR-4306抑制食管癌细胞恶性表型的分子机制。方法:1.应用qRT-PCR技术检测miR-4306在食管癌组织、癌旁组织和食管癌细胞系的表达水平。2.应用RTCA-MP系统、平板克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞仪观察过表达/低表达miR-4306对食管癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响。3.Western blotting检测过表达/低表达miR-4306对MMP-2、N-cadherin、Ecadherin分子水平的改变。4.应用miRDB、Targetscan、TargetMiner和miRWalk四个数据库预测miR-4306的潜在靶点,并通过双荧光素酶报告实验验证miR-4306与靶基因SIX3结合。5.应用qRT-PCR和Western blotting检测过表达/低表达miR-4306对SIX3mRNA水平和蛋白水平的影响。6.应用Western blotting检测食管癌细胞系中SIX3的表达量,通过RTCA-MP系统、Transwell实验观察过表达SIX3对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。7.应用RTCA-MP系统检测共转染SIX3质粒和miR-4306 mimic对食管癌细胞增殖能力的影响。结果:1.qRT-PCR实验显示,对癌旁组织相比,miR-4306在食管癌组织表达水平明显下降(P<0.05);与正常食管永生化细胞NE3相比,miR-4306在食管癌细胞中表达水平也显著下降。2.miR-4306 mimic或inhibitor转染食管癌细胞48h后,RTCA-MP系统和平板克隆形成实验显示,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE410和KYSE450的增殖能力明显减少,克隆形成数目也明显减少(P<0.05,P<0.01,P<0.001);而转染miR-4306 inhibitor的食管癌细胞KYSE140和KYSE150的增殖能力增加,克隆形成数目也明显增加(P<0.01)。Transwell实验表明,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE410和KYSE450的侵袭迁移能力明显减少(P<0.05,P<0.01),而转染miR-4306 inhibitor的食管癌细胞KYSE140和KYSE150的侵袭迁移能力增加(P<0.05)。流式细胞术表明,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE450显著促进了细胞凋亡能力(P<0.05),而转染miR-4306 inhibitor的食管癌细胞KYSE150显著抑制了细胞凋亡能力(P<0.05)。3.Western blotting实验表明,食管癌细胞KYSE450转染miR-4306 mimic后,EMT相关分子N-cadherin表达量减少、E-cadherin表达量增加,MMP-2表达量减少。而食管癌细胞KYSE150转染miR-4306 inhibitor后EMT相关分子N-cadherin表达量增加、E-cadherin表达量减少,MMP-2表达量增加。4.miRDB、Targetscan、TargetMiner和miRWalk四个数据库预测miR-4306的潜在靶点有86个,最终我们挑选了靶基因SIX3。双荧光素酶报告实验显示,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE410和KYSE450可明显抑制SIX3 3’-UTR结合位点野生型质粒的荧光素酶活性(P<0.001,P<0.05),不影响SIX3 3’-UTR结合位点突变型质粒的荧光素酶活性。5.qRT-PCR实验显示,与对照miR-NC相比,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE450中SIX3mRNA水平明显降低(P<0.05);转染miR-4306 inhibitor的食管癌细胞KYSE150中SIX3mRNA水平明显升高(P<0.05)。Western boltting实验显示,与对照miR-NC相比,转染miR-4306 mimic的食管癌细胞KYSE450中SIX3蛋白表达量明显降低;转染miR-4306 inhibitor的食管癌细胞KYSE150中SIX3蛋白表达量明显升高。6.Western blotting实验显示,与正常食管永生化细胞NE2和NE3相比,SIX3在食管癌细胞中高表达。通过RTCA-MP系统显示,过表达SIX3基因增加了食管癌细胞KYSE410和KYSE450的增殖能力(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。Transwell实验表明,过表达SIX3基因不影响食管癌细胞的侵袭迁移能力。7.RTCA-MP系统显示,与只转染miR-4306 mimic相比,共转染SIX3质粒和miR-4306 mimic后,食管癌细胞KYSE410和KYSE450的增殖能力有所增加。结论:1.miR-4306在食管癌细胞和组织中低表达,可知miR-4306在食管癌中是一个抑癌基因。2.miR-4306抑制食管癌细胞增殖、克隆形成和侵袭迁移能力,促进顺铂诱导食管癌细胞凋亡能力,并通过MMP-2,E-cadherin和N-cadherin影响食管癌细胞侵袭迁移能力。3.miR-4306通过与SIX33’-UTR结合,抑制SIX3表达从而抑制细胞的增殖。