第一部分:分离、培养的新生大鼠胰岛β细胞形态及功能鉴定目的:探讨体外培养的新生大鼠胰岛β细胞的功能状态。方法:采用胶原酶对1～3日龄Wistar大鼠胰腺组织进行分次短时消化。倒置显微镜观察接种18h细胞生长情况。继续培养72h,双硫腙(dithizone,DTZ)染色及胰岛素免疫组化染色鉴定β细胞,放射免疫法检测葡萄糖刺激下胰岛素分泌水平。结果:台盼蓝染色胰岛细胞存活率>90%,DTZ染色可染率>80%,细胞分泌功能正常。结论:胶原酶分次短时消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的分离培养方法为本实验提供了纯度较高、功能良好的胰岛细胞。第二部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预效应目的:探讨α-生育酚(α-tocopherol,α-T)对链脲菌素(strep- tozotocin,STZ)诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预效应。方法:1.分组:分离1～3日龄Wistar大鼠胰腺进行体外培养,培养的细胞随机分为4组:(1)对照组:培养的胰岛细胞不作任何干预处理;(2)α-T组:培养液中仅加入终浓度为20mg/Lα-T作用24h;(3)STZ组:培养液中仅加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min;(4)干预组:培养液中加入终浓度为20mg/Lα-T预处理24h后,再加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min。各组作用时间一到,即离心弃上清液,用新鲜培养液重悬细胞,继续培养18h后检测各项指标。2.方法:采用MTT比色法检测胰岛细胞活性,放射免疫法检测上清液中胰岛素含量,透射电镜观察细胞形态,Hochest33258荧光染色观察细胞荧光强度,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:与对照组比较,STZ组胰岛细胞活性、胰岛素含量明显降低,而胰岛细胞凋亡率显著升高(p<0.05)。同时,STZ组电镜观察到凋亡细胞,Hochest33258荧光染色发现发明亮淡蓝色强荧光细胞数显著增多(p<0.05)。而在STZ作用前给予α-T预处理的干预组,胰岛细胞活性、胰岛素含量及胰岛细胞凋亡率虽未恢复到对照组水平,但其下降和上升的程度较STZ组出现明显抑制(p<0.05)。结论:α-T能够抑制STZ所致胰岛β细胞凋亡而起到β细胞保护作用。第三部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预机理目的:探讨α-T对STZ诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预机理。方法:1.分组:同第二部分。2.方法:采用分光光度计测量上清液中总抗氧化能力(T-AOC)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平,一氧化氮合酶(NOS)活性、NO水平及胰岛细胞特异性半胱氨酸酶-3(caspase-3)活性、特异性半胱氨酸酶-8(caspase-8)活性。免疫组化法测定胰岛细胞bcl-xl、bax蛋白表达。结果:与对照组比较,STZ组上清液中T-AOC水平、SOD活性明显降低(p<0.05),MDA、NO水平显著升高(p<0.05),而NOS活性无显著性改变(p>0.05)。胰岛细胞caspase-3活性、caspase-8活性、bax表达明显升高(p<0.05),bcl-xl表达明显降低(p<0.05)。在STZ作用前给予α-T预处理的干预组,上述指标的变化虽未恢复到对照组水平,但其下降和上升的程度较STZ组出现明显抑制(p<0.05)。结论:α-T抑制STZ所致胰岛β细胞凋亡的机制与增强细胞抗氧化能力,清除自由基,减少脂质过氧化,从而降低caspase-3、caspase-8、bax/bcl-xl比例有关。第四部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤干预的剂-效关系目的:探讨α-T对STZ所致大鼠胰岛β细胞损伤干预的剂-效关系。方法:培养的胰岛细胞分为4组:(1)对照组:培养的胰岛细胞不作任何干预处理;(2)α-T组:培养液中仅加入终浓度为80mg/Lα-T作用24h;(3)STZ组:培养液中仅加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min;(4)干预组:培养液中加入终浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L及80mg/L的α-T作用24h后,再加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min。各组作用时间一到,即离心弃上清液,用新鲜培养液重悬细胞,继续培养18h后采用MTT法检测胰岛细胞活性、放射免疫法测定胰岛素含量、分光光度计测量上清液中T-AOC水平。结果:与STZ组比较,不同浓度α-T(5～80mg/L)干预组中胰岛细胞活性、胰岛素分泌量及T-AOC水平都有明显回升(p﹤0.05),该效应随α-T浓度的增加而增强,呈一定剂量依赖趋势(不同浓度干预组间比较p﹤0.05)。结论:α-T对胰岛细胞的保护作用呈一定剂量依赖趋势。