[目的]手足口病（Hand,foot,and mouth disease,HFMD）是儿童常见急性传染性疾病,多发生于5岁以下儿童,与肠道病毒感染有关。普通HFMD病例多具有自限性,但重症病例病情凶险,进展快,死亡率高。肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是重症手足口病的主要致病病原体,可引发HFMD重症,导致患者出现病毒性脑膜炎、脊髓灰质样综合征和神经源性肺水肿等严重的神经系统并发症,目前具体致病机制尚不明确。自噬（autophagy）是一种在进化中保守的、溶酶体依赖的分解代谢反应途径,具有生理和病理两方面作用。正常情况下,可作为细胞的一种生存机制帮助清除细胞内感染的细菌和病毒等微生物,发挥抗病毒天然免疫效应;但在一些研究中发现,细胞内自噬可被某些RNA病毒（如脊髓灰质炎病毒）利用、帮助其产生免疫逃避,从而导致重症疾病发生。EV71作为RNA病毒,在重症HFMD发生过程中,是否也会利用自噬途径产生免疫逃避导致重症发生?目前国内外有关于其在神经母细胞瘤细胞中引发自噬的研究,但对于其感染正常神经细胞后自噬是否发生鲜有报道。基于此,本文将小鼠海马细胞作为正常细胞研究对象,首次研究EV71感染其后细胞内自噬的发生情况,以期探讨发现EV71感染引发重症HFMD的关键致病机制。[方法]本研究主要通过体外EV71感染小鼠海马细胞,在感染不同时间点,分别检测细胞内自噬的发生以及病毒的复制情况,并对病毒与自噬之间的相互作用进行了初步实验研究。具体包括:1.自噬检测:首先通过光学显微镜观察EV71感染后小鼠海马细胞内空泡的产生情况,而后通过透射电镜确认自噬小体的存在;接着采用流式细胞术和Western Blot检测了自噬标志分子LC3-Ⅱ蛋白的表达情况,确认了自噬发生;2.病毒复制检测:通过Western Blot检测了感染细胞内EV71蛋白的表达情况;通过蚀斑实验检测确认EV71在被感染细胞内的滴度,确认病毒复制发生;3.病毒与自噬间的相互作用:采用免疫电镜检测EV71病毒蛋白定位;采用活细胞动态成像技术检测EV71-RNA与小鼠海马细胞内自噬小体间的相互作用,初步验证病毒是否利用自噬产生免疫逃逸。[结果]EV71感染小鼠海马细胞24h后,光学显微镜下可观察到细胞内空泡产生;透射电镜下可观察到少量自噬小体;随感染时间延长至48h,细胞内空泡及自噬小体逐渐增多;流式细胞术及Western Blot均检测到了 LC3-Ⅱ蛋白的表达,并且随感染时间延长,LC3-Ⅱ蛋白表达也逐渐增加;而在加入自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）后,LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低;提示EV71感染引发小鼠海马细胞发生自噬;同时,我们采用Western Blot检测了感染细胞内EV71蛋白的表达情况,发现随感染时间延长,EV71蛋白表达逐渐增加;病毒蚀斑实验结果也显示随时间延长,病毒蚀斑数逐渐增多,即EV71病毒滴度增加,提示EV71在小鼠海马细胞内发生了复制;在确认自噬与病毒复制发生后,通过免疫电镜检测发现了 EV71感染细胞内的自噬小体附近聚集有大量的免疫胶体金颗粒包裹的EV71蛋白;此外,活细胞动态成像技术观察到了 CTAB量子点标记的EV71-RNA与EGFP-LC3标记的自噬小体在小鼠海马细胞内发生了共定位,初步证明EV71-RNA与自噬小体间存在相互作用,并且病毒可能大量聚焦在自噬小体周围未被降解。[结论]基于上述实验结果,我们认为,EV71感染小鼠海马细胞后,不仅可以在细胞内发生复制,而且能够诱导其发生自噬;此外,还推测EV71可能利用自噬途径产生免疫逃逸,从而导致重症疾病发生。本研究将为探究发现EV71感染引发重症HFMD的关键致病机制提供新的研究思路。