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目的肿瘤的复发和耐药是临床治疗失败的主要因素,针对肾癌复发或者VI期晚期肾癌患者,NCCN指南推荐以抗血管新生药物为主的治疗方案,在临床实践中发现,对抗血管新生药物治疗的患者很快就会发生耐药,为了探索抗血管新生药物舒尼替尼在肾癌治疗中耐药的原因,发现潜在的耐药靶点,揭示sunitinib耐药的机制,寻找逆转耐药的治疗策略。我们对本课题组的三对control和treatment组的细胞进行了全外显子和RNA-seq的测序,通过全外显子的突变检测分析导致获得性耐药表型出现的重要突变基因;对RNA-seq的差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析,对细胞的功能、参与的生物途径及细胞中的定位以及受影响显著的信号通路进行注释。结合生物信息学样本数据库的信息,预测其可能的耐药调控机制,并通过分子生物学的方法来进行验证。方法1.对全外显子的测序数据进行质量评估、序列比对、突变检测分析,对发现的突变基因进行信号通路注释,并对发现的EP300的突变位点进行注释和可视化分析,应用c Bio Portal和GEPIA在线数据库对EP300突变和表达量做预后分析。2.对转录组表达谱的测序数据进行质量评估、序列比对、差异表达分析和转录组的一致性评价;应用DAVID网站对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析,并对富集结果进行可视化分析。3.对富集分析发现的受影响显著的信号通路上游调控基因进行挖掘,应用c Bio Portal在线分析网站对发现的调控基因进行共表达分析。4.应用EP300抑制剂C646和敲减的方法来验证EP300是否调控PTPN6的表达以及能否导致肿瘤细胞对sunitinib的耐药进行探索性分析。结果1.通过全外显子测序数据的变异检测分析,突变的EP300通过KEGG信号通路注释发现对信号通路的功能影响显著;EP300突变在肾透明细胞癌中的发生率不高;肾透明细胞癌中癌和癌旁组织的EP300的表达量没有差异,EP300表达量和患者的OS和PFS呈正相关性。2.样本间的Person相关系数(R2>0.9)、层次聚类分析和PCA的方法结果表明样本间基因表达差异性很小;通过差异表达基因的聚类分析,能够将control组和treatment组明显分开;差异表达基因的GO和KEGG富集分析,分子功能(MF)富集在蛋白二聚体的活性,细胞组分(CC)富集在胞浆膜,生物学功能(BP)富集在信号转导,KEGG富集在肿瘤的信号通路。3.c Bio Portal共表达分析结果发现EP300和KIT、EP300和PTPN6表达之间具有弱相关性;和对照组相比较,EP300和KIT基因在treatment组中表达上调,PTPN6表达下调。4.敲减或抑制EP300以后,和对照组相比,KIT基因表达量明显上调,PTPN6的表达量没有差异;抑制EP300,对照组和处理组的IC50没有差异;敲减EP300后,处理组的IC50值大约是对照组的2倍。结论1.通过全外显子测序我们发现了EP300发生截短突变,通过信号通路的注释分析,发现EP300突变对下游众多的信号通路影响显著,可能是sunitinib耐药基因。2.通过RNA-seq数据差异表达基因的GO和KEGG富集分析,下游信号通路的改变可能是诱导肿瘤细胞对sunitinib耐药的原因。3.EP300没有调控PTPN6的表达;EP300和KIT基因的表达之间可能具有相关性,敲减EP300可以诱发ACHN细胞对sunitinib的耐药。