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背景与目的炎症性肠病(Inflammationbowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease,CD),是一组病因不明的肠道炎症性疾病,其发病率逐年上升,已成为一种全球性疾病。遗传易感性、肠道粘膜屏障的破坏、肠道菌群的改变以及免疫功能失调等都可能造成IBD,其中免疫功能失调发挥重要作用。IBD个体循环及局部免疫细胞的类型及数量显著异常,肠道中浸润的炎性细胞增多,并释放大量的炎性因子,破坏正常肠道组织。目前,抑炎药物是IBD治疗的主流方案,但治疗缺乏精准靶点,因此精准解析IBD的免疫机制对于IBD的治疗具有重要意义。免疫检查点分子是抑制免疫细胞过度活化的重要免疫调节分子,其表达和功能异常参与多种疾病,以免疫检查点分子PD-1、CTLA-4为靶点的抗体药物已经在抗肿瘤临床治疗中取得显著疗效。动物及临床研究均显示,肠炎是PD-1抗体和CTLA-4抗体治疗肿瘤的常见不良反应,提示免疫检查点分子在维持肠道稳态方面发挥重要作用。揭示免疫检查点分子在结肠炎中的作用有助于全面理解IBD的免疫发病机制,寻找新的免疫干预靶点。Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)作为重要免疫检查点分子,调控T细胞免疫应答,在癌症、慢性病毒感染等多种疾病中发挥作用。越来越多的研究发现,除T细胞外,Tim-3在巨噬细胞、NK细胞等多种免疫细胞表面表达,并影响它们的功能。已有文献报道,肠炎个体不同免疫细胞中Tim-3表达变化,但Tim-3在肠炎中的具体作用及其调控的关键免疫细胞尚不明确。本论文利用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)在Tim-3基因敲除(Tim-3KO)鼠中诱导急性溃疡性结肠炎,结合多种免疫学技术及分子生物学技术,研究Tim-3在结肠炎小鼠中的表达谱和具体作用,并探讨参与Tim-3调控肠炎的关键免疫细胞,以期为IBD的治疗提供新思路。方法与结果1、肠炎后免疫细胞亚群改变首先,我们利用3.5%DSS饮水诱导小鼠急性结肠炎,并通过流式细胞术检测小鼠肠系膜淋巴结和结肠固有层的免疫细胞亚群变化,结果显示,与正常饮水的对照小鼠相比,DSS处理的小鼠结肠中CD3+T细胞比例减少,CD3-细胞比例增多,流式细胞术分析显示,增多的CD3-细胞中以CD45+CD3-CD19+B细胞为主,RT-qPCR及免疫组化检测同样证实,结肠组织中CD19表达明显增加,提示B细胞参与肠炎发生发展的过程。为了验证上述动物实验结果,我们从Gene Expression Omnibus(GEO)在线数据库下载了基因芯片GSE9452和GSE38713,选取溃疡性结肠炎患者疾病活动期结肠组织与正常对照标本进行差异表达分析。结果显示,与动物实验一致,B细胞激活及分化相关基因富集且表达上调,提示溃疡性结肠炎患者体内B细胞增多。2、肠炎小鼠肠道多种免疫细胞Tim-3表达显著升高,敲除Tim-3小鼠肠炎加重为了检测Tim-3在肠炎小鼠中的表达变化,我们分离正常对照小鼠与DSS诱导结肠炎小鼠的脾、肠系膜淋巴结和结肠固有层的免疫细胞,流式细胞术分别检测多种细胞亚群表面的Tim-3表达。结果显示Tim-3不仅表达于T细胞表面,在B细胞表面也有表达。并且在小鼠肠炎发生后,Tim-3在多种免疫细胞表达升高,以结肠固有层中B细胞升高最为显著。免疫组化及免疫荧光获得了相同结果,即肠炎小鼠结肠组织中B细胞显著增多。进一步在基因芯片GSE9452和GSE38713中对Tim-3表达进行分析,数据分析显示,溃疡性结肠炎患者结肠较健康对照组Tim-3表达增加,且Tim-3与免疫负调节分子TGF-β、IL-10明显相关。为了明确Tim-3在肠炎中的作用,我们同时给予C57BL/6 WT小鼠和Tim-3KO小鼠3.5%DSS饮水诱导急性肠炎。观察显示,与WT对照小鼠相比较,Tim-3KO小鼠体重减少更为严重、结肠长度变短,且肠道通透性检测结果证明,Tim-3KO小鼠肠道通透性增加,HE染色结果显示,Tim-3KO小鼠结肠炎性浸润增加,肠道组织损伤加重,提示Tim-3KO小鼠比WT小鼠的肠炎更加严重。流式细胞术分析小鼠脾和肠系膜淋巴结中的免疫细胞亚群。结果显示,相比WT小鼠,Tim-3KO肠炎小鼠体内CD3+T细胞进一步减少,CD3-细胞进一步增多。CD19免疫组化结果显示,Tim-3KO小鼠结肠及肠系膜淋巴结中B细胞增多。3、B细胞负调节肠炎,敲除Tim-3后其保护作用消失为明确B细胞在肠炎中的作用,我们利用中和抗体体内清除B细胞,并在B细胞缺陷的条件下诱导肠炎。小鼠体重、结肠长度、肠道通透性检测以及结肠病理切片观察证实,B细胞清除后小鼠体重减少更为严重、结肠长度变短、肠道损伤严重并伴有通透性增加,即B细胞清除加重小鼠肠炎加重。流式检测表明,清除B细胞的肠炎小鼠多种免疫细胞亚群Tim-3表达降低,提示B细胞活化影响Tim-3表达。为验证Tim-3是否对B细胞的功能产生影响,我们使用Tim-3KO小鼠腹腔注射B细胞中和抗体造成B细胞缺陷后诱导肠炎。结果显示,与WT小鼠B细胞清除加重肠炎不同,Tim-3KO小鼠清除B细胞后的肠炎小鼠在体重、结肠长度及病理切片方面与同型对照抗体处理KO小鼠均无显著差异,且结肠切片CD45+细胞减少、血清中FITC荧光值以及TNF-α水平降低,提示Tim-3敲除完全逆转了 B细胞对肠炎的保护作用,提示B细胞的保护作用依赖于Tim-3。研究结论综上,本研究利用DSS诱导的小鼠急性肠炎模型,首次明确了在急性肠炎发展的过程中,浸润的免疫细胞尤其是结肠固有层的B细胞表面Tim-3表达显著升高,敲除Tim-3后,肠炎明显加重。B细胞在肠炎发生后数量增多,抑制DSS诱导肠炎,且B细胞对肠炎的保护作用可能依赖于Tim-3。