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溃疡性结肠炎(UC)是一种非特异性的结肠炎症，病变主要累及结肠粘膜和粘膜下层。其病因和发病机理至今仍不清楚，目前大多数研究认为与免疫反应的异常有关。各种生化介质，包括细胞因子，生长因子，粘附分子，一氧化氮等在介导这一异常的免疫反应中起着重要作用。
许多研究己证实核转录因子-κB(NF-κB)在UC的发展中对炎症介质中调节起着重要的作用。NF-κB是由二个亚单位组成的同源或异源二聚体，是一类能与多种基因启动子位点发生特异结合并增强其转录的一种蛋白质因子，大多数细胞因子基因启动子部位都含有NF-κB结合位点，在细胞未受到刺激时，存在于细胞浆内未活化的NF-κB被其抑制蛋白IκB结合，当细胞受相应的刺激后，IκB被降解，NF-κB被释放，移位至细胞核内与基因κB位点结合，促进相关基因的转录。
因此，从NF-κB角度研究溃疡性结肠炎的发病机理进而寻找治疗新策略和新药物是溃疡性结肠炎研究的新方向，具有深远的理论意义和临床实用价值。
对于UC的治疗，氨基水杨酸类、激素是常用有效控制症状药物，但这些药物并不能影响该病自然病程，最近几年UC的分子病理机制研究取得了长足的进展，UC的生物基因治疗有了很大发展。
随着对肠黏膜免疫的深入研究，越来越多证据显示肠黏膜上皮细胞(IEC)不仅作为固有屏障，而且也作为免疫活性细胞参加肠黏膜天然免疫反应。TLR4是新近发现的天然免疫系统中的细胞跨膜受体，是联系天然免疫与后天免疫的桥梁。TLR4能介导肠上皮细胞对细菌胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的产生高反应性，最终导致NF-κB激活，所以TLR4是将LPS信号由胞外传向胞内的关键信号分子。而IL-8是一种重要的炎症趋化因子，能趋化肠粘膜固有层炎性细胞，放大了免疫反应，其表达受细胞内激活的NF-κB调控。本课题通过对溃疡性结肠炎患者肠黏膜上皮细胞中TLR4、IL-8、NF-κB p65的表达，及三者之间相互关系的研究，以探讨其在UC发病机理中的作用。由于原代培养结肠上皮细胞非常困难，体外研究肠上皮细胞生物学活性时，多采用与肠上皮细胞生物学特性相似的结肠腺癌细胞进行研究。我们选用了与正常肠上皮细胞具有相似细胞免疫学特性的，并且对LPS敏感，经LPS刺激后高表达TLR4的人结肠腺癌细胞系SW480细胞，用LPS刺激SW480细胞，在体外模拟肠道炎症环境，探讨NF-κB decoyODNs对炎症状态时的SW480细胞NF-κB p65 DNA结合活性和SW480细胞分泌TLR4、IL-8表达的影响。
第一部分：TLR4、IL-8、NF-κB p65在溃疡性结肠炎中的表达
目的：通过检测人正常结肠粘膜和不同程度的UC结肠粘膜TLR4、IL-8、NF-κB p65的表达差异，探讨三者在UC发病机制中的作用。
方法：收集UC病例及正常对照结肠镜活检标本或手术标本。采用免疫组化法检测TLR4、IL-8、NF-κB p65的表达。根据Powell-Tuck等评分系统定量计算疾病活动度(DAI)的分值。按照Truelove-Richards标准进行病理学分级。
结果：
1、对照组结肠粘膜上皮细胞和固有层TLR4、IL-8、NF-κB p65染色均为浅棕黄色，OD值分别为(0.108±0.007；0.103±0.021；0.110±0.038)，在UC组结肠粘膜表面上皮细胞和固有层TLR4、IL-8、NF-κB p65染色为深棕黄色，OD值较对照组表达均显著增强(P<0.05)。
2、TLR4、IL-8、NF-κB p65表达的OD值分别与DAI呈正相关，(r=0.819，p=0.001；r=0.948，.p=0.0001；r=0.945，p=0.0001)。TLR4、IL-8、NF-κB p65表达的OD值与病理分级有关，Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅰ级比较、Ⅲ级与Ⅱ级比较差异均有显著性(p<0.05)。TLR4、IL-8和NF-κB p65呈正相关(r=0.857，P=0.0001；r=0.980，P=O.0001)o
第二部分：NF-κB decoy ODNs对LPS刺激SW480细胞后NF-κB p65 DNA结合活性的影响
目的：研究NF-κB decoy寡核苷酸对LPS刺激SW480后，对NF-κB p65DNA结合活性的影响。
方法：
1、体外培养SW480细胞，
2、ODN序列设计合成NF-κB decoy ODNs：5-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-33-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5 Scrambled decoy ODNs：5-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-33-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5
3、用LPS(10μg/L)刺激后，用脂质体lipofectin2000介导NF-κB decoyODNs转染。
4、实验分组：对照组(加入同等体积含同等剂量的无血清无抗生素1640培养液)；LPS组：LPS刺激3h；NODN组：LPS刺激3h后转染1μmol/L的NF.r.B decoy ODNs；SODN组：LPS刺激3h后转染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000组：LPS刺激3h后加入同等剂量lipofectin2000。转染6h。
5、TransAMTM法检测细胞核NF-κB p65的DNA结合活性和Western blot法检测NF-κB p65细胞核含量。
结果：
1、LPS刺激SW480细胞后SW480中NF-κB P65 DNA结合活性明显高于对照组(P<0.01)，而且NF-κBP65蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)。
2、NF-κB decoy ODNs转染后，SW480细胞NODN组的NF-κBP65 DNA结合活性显著低于LPS组(P<0.01)，但是NF-κB P65蛋白表达与LPS组无明显差异(P>0.05)。
3、Scrambled decoy ODNs组和lipofectin2000组对NF-κB P65 DNA结合活性和NF-κB P65蛋白表达与LPS组间无明显差异(P>0.05)。
第三部分：NF-κB decoy ODNs对LPS刺激SW480细胞后TLR4、IL-8表达的影响
目的：研究NF-κB decoy ODNs对LPS刺激SW480细胞后，对TLR4、IL-8表达的影响。
方法：
1、体外培养SW480细胞，
2、ODN序列设计合成NF-κB decoy ODNs：5-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-33-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5Scrambled decoy ODNs：5-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-33-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5
3、用LPS(10μg/L)刺激后，用lipofectin2000介导NF-κB decoy ODNs转染。
4、实验分组：对照组(加入同等体积含同等剂量的无血清无抗生素1640培养液)；LPS组：LPS刺激3h；NODN组：LPS刺激3h后转染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs；SODN组：LPS刺激3h后转染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000组：LPS刺激3h后加入同等剂量lipofectin2000。转染6h。
5、收集细胞上清液，用ELISA法检测IL-8；提取细胞mRNA，经RT-PCR法检测TLR4mRNA、IL-8mRNA的表达。
结果：
1、LPS刺激SW480细胞后，TLR4mRNA、IL-8mRNA和IL-8的表达较对照组明显增高(P<0.01)。
2、NF-κB decoy ODNs明显的抑制了LPS刺激SW480细胞后TLR4mRNA、IL-8mRNA和IL-8的高表达(P<0.01)。
3、各组实验中用Scrambled decoy ODNs和lipofectin2000干预对TLR4、IL-8都无明显的影响(P>0.05)。
结论：
1、在UC肠粘膜中TLR4、IL-8、NF-κB p65表达显著上调，说明TLR4、IL-8、NF-κB p65参与了UC的发生和发展。
2、在UC中，TLR4、IL-8与NF-κB p65呈正相关。证实NF-κB p65在UC发生发展中是一种重要的转录因子，调节UC肠上皮炎症反应的基因。
3、NF-κB decoy ODNs在体外明显抑制LPS刺激SW480细胞后的NF-κBp65的DNA结合活性。
4、NF-κB decoy ODNs在体外明显抑制LPS刺激SW480细胞后的TLR4、IL-8的表达。