【摘 要】
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目的:血管性血友病（Von Willebrand disease,VWD）是一种由患者血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）基因突变而导致的常染色体遗传疾病。VWF的数量减少,结构或功能异常均会导致VWD。根据VWF的发病机制及临床表现的轻重,VWD被分为:1型VWD、2型VWD和3型VWD。3型是VWD中最严重的类型,发病率约为0.5～1/100万,其病人血浆当中
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目的:血管性血友病（Von Willebrand disease,VWD）是一种由患者血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）基因突变而导致的常染色体遗传疾病。VWF的数量减少,结构或功能异常均会导致VWD。根据VWF的发病机制及临床表现的轻重,VWD被分为:1型VWD、2型VWD和3型VWD。3型是VWD中最严重的类型,发病率约为0.5～1/100万,其病人血浆当中的VWF完全或几乎完全缺失,结构和功能大多也存在异常,这会导致严重的出血现象,甚至造成自发性关节出血,肌肉出血及内脏出血,严重时威胁病人的生命。研究3型VWD的分子发病机制,有助于了解VWF蛋白的结构与功能的关系,对于临床诊断、治疗和预后都有重要意义。在本课题中,我们旨在分析1例3型VWD病人的临床特征和实验室诊断,使用基因测序和一些其他生物学技术手段,阐明该系3型VWD的分子发病机制,并由该发病机制进一步探讨VWF分子结构与生理功能之间的关系。方法:1.取先证者静脉血,制备富含血小板血浆,测定瑞斯托霉素诱导的血小板聚集;离心分离血浆,使用全自动凝血仪测量APTT和FVIII:C,并使用试剂盒测量患者的VWF:Rco、VWF:Ag、FIX:C、FXI:C、FXII:C。2.将先证者及其家系成员血浆与上样缓冲液混合,使用1.5%SDS-琼脂糖胶进行电泳分离,并用抗VWF抗体做蛋白免疫印迹分析,比较VWF多聚体分布。3.提取先证者及其家系成员外周血细胞DNA,进行二代测序分析,然后针对二代测序发现的VWF基因错义突变,设计引物扩增突变位点前后的DNA,使用一代测序法进行验证。4.以包含野生型人源VWF全长c DNA序列的表达质粒为模板,使用基于PCR的定点突变法将VWF c DNA序列的8171位G突变为A,并使用基因测序的方法验证定点突变的准确性,从而构建出VWF C2724Y表达质粒。5.将空载质粒、VWF WT质粒、VWF C2724Y质粒以及两种质粒混合物转入HEK-293T细胞。将转染48小时后的细胞裂解液和细胞上清做还原（上样缓冲液含β-巯基乙醇）和非还原（上样缓冲液不含β-巯基乙醇）SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,转PVDF膜后孵抗VWF抗体做Western blot和VWF多聚化分析,检测重组VWF C2724Y蛋白的表达以及分泌情况。结果:1.先证者APTT延长至66.8秒,1:1血浆可以完全纠正（28.1秒）,Risto诱导血小板聚集（1.2mg 0,0.6mg 0）,VWF:Ag 2%,FVIII:C2%,VWF:Rco:1.5%,FVIII:C 2%,FXI:C 102%,FIX:C 65%,FXII:C86%。2.VWF多聚体分析的结果显示,先证者血浆中的VWF因子严重缺失,几乎没有VWF因子存在,而其父母血浆中VWF因子含量及分布与标准血浆无区别。3.二代基因检测结果显示,先证者为复合型杂合突变,一条VWF基因发生c.3814del T:p.C1272fs突变,来自母亲;另一条等位基因发生c.8171G＞A:p.C2724Y突变,来自其父亲。4.基因测序结果表明,VWF 8171G＞A（VWF C2724Y）表达质粒构建成功。5.细胞裂解液及细胞培养上清的Western blotting结果显示,VWF WT蛋白在HEK-293T细胞裂解液和细胞培养上清中都有表达,但VWF C2724Y突变蛋白以pro-VWF形式在HEK-293T细胞中积累,不能分泌到细胞外。6.VWF多聚体分析结果显示,在HEK-293T细胞裂解液中,VWF野生型蛋白主要以二聚体形式存在,而VWF C2724Y突变蛋白主要以proVWF形式存在,也有少量成熟VWF单体,没有二聚体形式;在细胞培养上清中,只有VWF野生型蛋白,且其多聚体分布正常,而没有VWF C2724Y突变蛋白表达。结论:1.我们发现了一个新的3型VWD家系,其VWF基因发生了复合型杂合突变,一个突变为c.3814del T:p.C1272fs,另一个突变为c.8171G＞A:p.C2724Y,这两个突变均为首次报道。2.VWF C2724Y（8171G＞A）突变可导致VWF蛋白不能形成二聚体,也不能释放到细胞外,致使血浆中VWF蛋白缺乏,是该家系的分子致病机制。3.VWF C2724Y突变导致3型VWD的发现完成了CK结构域二硫键功能的最后一块拼图,我们得出重要论断:CK结构域中任何一个链内二硫键的破坏都会导致3型VWD。
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