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背景:PRKAG2心脏综合征主要临床表型为:心肌肥厚、心室预激以及逐步进展的心脏传导系统病变,是一种少见的常染色体显性遗传性疾病,主要由于编码激活腺苷-磷酸的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)γ2调节亚单位的PRKAG2基因发生突变。AMPK广泛存在于哺乳动物的组织中,被称为“细胞能量调节器”,通过调节葡萄糖和脂质代谢维持细胞内能量平衡,是由催化亚基α和调节亚基β、γ三个亚单位组成的异源三聚体蛋白,γ2亚基包含4个由60个氨基酸组成的胱硫醚β-合成酶(CBS)区域,它们串联形成Bateman结构域。Bateman结构域结合AMP能力变化能引起AMPK活性改变,从而改变细胞能量代谢和平衡。截止目前,国际上报道了不少于20个位于常染色体7q3上AMPKγ2亚基突变的PRKAG2心脏综合征家系,共有11种PRKAG2基因突变,并证实所有的突变都集中在γ2亚基的CBS区域,导致该区域的Bateman结构域结合AMP能力降低从而导致以上典型的PRKAG2心脏综合征症状。长海医院心内科的张静博士于2007年首次报道了汉人特有的PRKAG2心脏综合征家系并进行了跟踪基因测序,此家系同样具有国外报道家系的共性:心肌肥厚、预激综合征,高度房室传导阻滞和窦房结功能不良、猝死以及房扑、房颤等房性心率失常等。但不同于以往所有报道的位于CBS区的突变,我们测序发现的G100S突变位点位于非CBS区的外显子3上,而国外报道的所有位点测序完全正常。是否位于非CBS区域的G100S突变与位于CBS区的突变位点一样能引起AMPK功能的改变,其导致AMPK功能改变的生物学效应和CBS区的突变比较是否一致,为此前期课题组已经做了相关的研究:在离体细胞水平证明了此基因突变可引起动作电位的改变,初步探讨了此突变引起心律失常的机制;在鱼类水平上,证明了G100S突变可引起心脏肥大,并探讨了其相关机制。鉴于斑马鱼模型不能行心电图检查,不能在症状方面进行心律失常的鉴定,故目前在心律失常方面研究存在不足,为进一步研究G100S突变在整体哺乳动物水平是否引起心肌肥大及心律失常,其致病机制如何,转基因小鼠模型具有无可比拟的优势。课题组通过构建和人基因同源性更接近的哺乳类动物的转基因模型进行深入研究。而此次构建的过表达PRKAG2(G100S)突变的转基因小鼠模型,通过对其症状表型的观察及作用机制深入研究,有助于加深对AMPKγ2亚基非CBS区域功能的认识,对全面研究此突变位点在汉人PRKAG2心脏综合征家系中的临床表型及其机制具有至关重要的作用和价值。并可能为以后治疗这一中国人特有的PRKAG2心脏综合症提供全新的思路。目的:本研究通过构建PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,观察其心肌肥大和心律失常等表型,并进一步探讨和研究新突变G100S在PRKAG2心脏综合征中导致心肌肥大和心律失常致病机理。方法:(1)PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的构建:我们选择心脏特异表达的小鼠Myh6(α-MHC)基因启动子驱动PRKAG2(G100S)表达,通过分子克隆将PRKAG2(G100S)片段与Myh6(α-MHC)Promoter及poly A连接,并在两侧添加用于稳定表达的insulator元件。使用转基因片段最外侧的内切酶释放转基因片段,通过原核注射技术将转基因DNA片段注射至小鼠受精卵原核内,将注射后的受精卵移植到假孕雌鼠输卵管中,雌鼠妊娠并产仔后,剪小仔尾尖抽提基因组DNA进行PCR鉴定,确认携带转入基因片段的转基因鼠。获得的转基因首建鼠(founder)与野生型C57BL/6J小鼠回交,取其转基因阳性的后代,应用q PCR技术及Western Blot-蛋白质印迹技术确认转入基因在心脏高表达。并将转基因小鼠心脏提取的RNA反转录成c DNA,测序明确突变基因G100S在心脏表达。(2)PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型心肌肥大表型及其机制研究:以同窝野生型小鼠(WT)为阴性对照组,PRKAG2(G100S)转基因小鼠(TG)为实验组,应用超声检测转基因小鼠和同窝野生型小鼠的心脏,明确其有无心脏肥大;通过称量小鼠心脏干重和体重,明确心重/体重比值有无统计学意义;通过心脏HE染色等组织病理学检查明确转基因小鼠心脏肥大的组织学表现;应用PAS染色明确转基因小鼠心肌细胞内有无糖原沉积;应用AMPK试剂盒检测技术,明确突变基因G100S在转基因小鼠心肌细胞内的活性如何改变。(3)PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型心律失常表型及其机制研究:心电图检测转基因小鼠有无心律失常表型;通过共聚焦技术检测急性分离的成年转基因小鼠心肌细胞,明确其细胞内的钙离子稳态有无改变。结果:(1)成功构建了含有此突变基因的载体序列,并应用原核注射技术成功构建了PRKAG2 G100S转基因小鼠模型,通过q PCR和Western Blot技术验证了在F2代的转基因小鼠的心脏上,此突变基因能稳定传代并稳定高表达;(2)通过超声结果显示(WT vs TG):IVS-d(0.858±0.081 vs.1.31±0.216 mm,n=6,p<0.01),IVS-s(1.211±0.184 vs.1.695±0.144 mm,n=6,p<0.01),LVPW-d(0.687±0.114 vs.1.063±0.159mm,n=6,p<0.01),LVPW-S(1.013±0.108 vs.1.370±0.083 mm,n=6,p<0.01)and LV Mass(94.11±7.25 vs.193.23±54.41 g,n=6,p<0.01),证实了PRKAG2 G100S转基因小鼠有心肌肥大的表型;HE染色证实了其心肌细胞排列紊乱,心肌细胞上有坏死的液泡等组织学表现;PAS染色明确了转基因小鼠心肌细胞内糖原大量沉积;AMPK试剂盒检测技术分别检测野生型和转基因型心脏组织,结果为n=3,P=0.0046,显示有统计学差异,证实了突变基因G100S在转基因小鼠相比同窝野生型小鼠心肌细胞内的活性降低。(3)心电监测暂未观察到小鼠心律失常,但通过共聚焦线扫,在138S内钙波的个数统计结果显示WT vs TG(1.2±1.316 vs 6.3±2.312个,n=10,P<0.01),证实突变基因能引起心脏细胞内钙稳态的改变。结论:本课题成功构建了PRKAG2(G100S)过表达的转基因小鼠模型,证实了此G100S突变基因可以引起转基因小鼠的心脏肥大,其致病机制同目前报道的CBS区的突变致病机理一致,通过降低AMPK活性,引起心肌细胞内糖原沉积,最终导致心肌肥大。心律失常的心电图表型尽管未能观测到,但随后应用共聚焦对转基因小鼠急性分离的心肌细胞进行破膜检测,发现其细胞内钙离子稳态发生了改变,证明我们的心律失常表型是客观存在的,只是目前采用的心电图检测技术未能抓取,后期可考虑用其他技术如皮下植入24小时动态心电图观测。总之,通过此转基因小鼠模型的建立,证实了此突变基因能引起心脏肥大,并为以后进一步深入研究心律失常提供了良好的研究模型,意义重大。