论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,越来越多的研究证据表明,小胶质细胞介导的炎症反应在AD的发病过程中发挥着重要作用。淫羊藿素(icaritin,ICT)作为淫羊藿总黄酮主要活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)的衍生物,属于植物雌激素,具有抗肿瘤、抗炎和神经保护等作用。研究显示ICT可以抑制Aβ25-35诱导的大鼠原代皮层神经元的凋亡,但其是否能够通过抑制小胶质细胞激活产生的炎症反应,保护海马神经元,改善学习记忆,目前尚未见报道,其可能的作用靶点和分子机制亦需进一步探讨。G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)是一种膜性雌激素受体,主要定位于细胞膜和内质网膜等结构,且广泛表达在海马的齿状回,CA1和CA3区域。GPER能够被快速激活并参与雌激素的非基因组快速效应。已有文献报道ICT可以通过调节GPER-表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)-有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路来刺激乳腺癌SKBr3细胞的增殖。本实验室前期研究证实ICT能够通过胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)信号途径对抗神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP~+)对多巴胺能神经元MES23.5细胞的损伤,提示IGF-1R信号通路可能参与ICT的神经保护作用。由于GPER与IGF-1R信号途径间存在交互串话,我们提出ICT是否能够通过GPER和IGF-1R信号途径发挥其抗AD炎症反应的神经保护作用。本实验采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制备AD炎症模型,应用水迷宫、Real time PCR、免疫印迹及免疫组化等技术方法,研究ICT的抗炎作用及其可能的分子机制。结果如下:1.水迷宫实验结果显示,与对照组相比,LPS模型组小鼠的潜伏期增加、目的象限时间比及平台穿越次数明显减少(P<0.05,P<0.01,P<0.001);不同剂量的ICT(5、10、20mg/kg)预保护能够明显对抗LPS诱导的小鼠行为学改变(P<0.05,P<0.01)。2.Real time PCR结果显示,LPS模型组其海马区炎性因子TNF-α、IL-1β及炎性因子限速酶COX-2、iNOS的基因表达较对照组明显上调(P<0.05,P<0.001);不同剂量的ICT(5、10、20mg/kg)对上述炎性因子的基因表达有显著的抑制作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。3.Western blot结果显示,不同剂量的ICT(5、10、20mg/kg)预保护对LPS诱导的COX-2和iNOS的蛋白表达均有抑制作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。在后续实验中,我们选用了10mg/kg的ICT,进行机制探讨。4.灌胃给予ICT前,侧脑室注射GPER的特异性阻断剂G15,观察其对ICT抗炎作用的影响。结果显示,与ICT给药组相比,G15+ICT组小鼠的水迷宫实验其潜伏期明显增加、目的象限时间比及平台穿越次数减少(P<0.05);海马区炎性因子TNF-α、IL-1β的基因表达明显增加(P<0.01);COX-2、iNOS的基因和蛋白表达均增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。G15+LPS组与LPS组相比,以上各指标均无明显差异。5.灌胃给予ICT前,侧脑室注射IGF-1R的特异性阻断剂JB-1,观察其对ICT抗炎作用的影响。结果显示,JB-1亦能够阻断ICT对LPS诱导的AD炎症模型的抗炎作用(P<0.05,P<0.01)。JB-1+LPS组与LPS组相比以上各指标均无明显差异。单用ICT组对上述指标亦无影响。6.与对照组相比,LPS模型组MAPKs信号通路中ERK、JNK和p38的蛋白磷酸化水平明显增加(P<0.01,P<0.001),而ICT给药组上述蛋白的磷酸化水平明显降低(P<0.05,P<0.001),此作用可以被G15所阻断(P<0.05);JB-1预处理可以部分阻断ICT对上述蛋白磷酸化的抑制作用,其中p38的磷酸化水平较ICT给药组明显升高(P<0.05),ERK和JNK的磷酸化虽有一定程度的增加,但无统计学意义(P>0.05)。G15+LPS或JB-1+LPS组与LPS组相比,均无明显差异。7.为检测本实验模型中小胶质细胞的激活状态,我们应用western blot和免疫组化技术检测小鼠海马区小胶质细胞特异性标志物Iba-1的蛋白表达。Western blot结果显示ICT能够明显抑制LPS诱导的Iba-1的蛋白表达(P<0.05);此作用可以被G15或JB-1所阻断(P<0.05)。G15+LPS或JB-1+LPS组与LPS组相比均无明显差异。此结果与免疫组化检测结果一致。8.尼氏染色结果显示ICT能够明显改善LPS引起的海马CA1区和CA3区神经元的损伤(P<0.05);G15或JB-1均可阻断ICT的保护作用(P<0.05)。G15+LPS或JB-1+LPS组与LPS组相比,均无明显差异。本实验结果表明,ICT在AD炎症模型中,能够抑制LPS诱导的小胶质细胞过度激活,改善小鼠的学习记忆能力。GPER及IGF-1R信号途径参与了ICT的抗炎神经保护作用。本研究为发掘具有潜在临床价值的前药提供了实验依据。