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透明质酸（Hyaluronic acid,HA）属于一种直链粘多糖,由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖双糖单位在β-1,3与β-1,4糖苷键两种糖苷键交替连接条件下组成。由于双糖单位的延伸程度不同,使透明质酸具有低、中、高三种分子量类型,并对应三种不同的生理功能。正因为独特的生理功能和理化性质,透明质酸已在食品、化妆品和医疗等多种领域发挥着重要的作用。当前,透明质酸的生产方法仍然以马疫链球菌兽疫亚种菌株为代表的发酵法为主,但马疫链球菌兽疫亚种生产透明质酸存在发酵成本高的问题,因此对马疫链球菌兽疫亚种进行发酵优化十分必要。此外,马疫链球菌兽疫亚种生产的透明质酸分子量通常都比较大,且高分子量的透明质酸在应用范围上会受到很大限制,因而,对高分子量透明质酸进行不同程度水解来制备不同分子量的透明质酸也是目前其开发研究的重点。首先,本研究以马疫链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp.zooepidemicus WTF 001）作为原始发酵菌株,为进一步提高透明质酸产量和降低发酵成本,分别对菌株进行诱变筛选和培养基及发酵条件优化。其次,为解决马疫链球菌兽疫亚种发酵生产的透明质酸分子量较高的问题,采用酶解法对高分子量透明质酸进行水解。本研究以安全级菌株毕赤酵母Pichia pastoris为宿主菌,异源表达水蛭来源的透明质酸酶（Leech HAase,简称LHAase）,并对LHAase酶学性质、水解特性以及发酵优化等进行研究。本文主要工作如下:（1）采用ARTP等离子诱变技术对原始菌株——马疫链球菌兽疫亚种（S.equi subsp.zooepidimicus WTF 001）进行诱变。使用平板初筛和摇瓶复筛的手段反复筛选,最终得到一株高产透明质酸的诱变菌株——马疫链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp.zooepidemicus WTF 101 CCTCC）。摇瓶水平发酵24小时,原始菌株与诱变菌株发酵结果对比,产量由0.34±0.01 g/L提升至0.55±0.02 g/L,产量提高了61.67%。（2）采用单因素实验和正交实验结合方式,对发酵培养基的组成配方进行优化,得到最优发酵培养基组成配方为:葡萄糖72 g/L、蛋白胨17.5 g/L、酵母浸粉10 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L。使用5-L多联发酵罐对马疫链球菌兽疫亚种WTF 101产透明质酸发酵控制参数进行优化,通过单因素实验,确定最佳发酵控制参数为:pH=7.0、接种量为15%、发酵温度为37℃、罐压0.05 MPa、初始通风强度为1 vvm、初始搅拌桨转速为200rpm、初始葡萄糖浓度为4%。碳源葡萄糖采用分批流加的方式,维持发酵罐内葡萄糖浓度在15-25 g/L之间。采用增加通风量和增加搅拌转速交替的方式,维持发酵罐内溶氧DO值在20%-50%之间。结合上述诱变后菌株和优化后的发酵条件,发酵周期在20-24小时内,透明质酸产量达12.2±0.2 g/L,产物转化率达16.94%,粘度达75000 m Pa·s,乳酸为45 g/L,与未优化条件下的透明质酸产量7.5±0.2 g/L相比,提高了62.67%。利用单因素实验和正交实验,确定发酵培养基中影响透明质酸产量和菌体量的关键氮源因子种类和含量,分别为:维生素B3 0.10 g/L、肌苷0.03 g/L、赖氨酸0.70 g/L、精氨酸0.70 g/L、苏氨酸0.90 g/L、丙氨酸1.40 g/L、组氨酸0.03 g/L、脯氨酸0.30 g/L。（3）本实验将水蛭来源透明质酸酶基因（属于透明质酸-3-糖基水解酶家族,EC3.2.1.36,LHAase）在Pichia pastoris GS115中异源表达。连接载体为p PIC9k,信号肽为α-signal peptide,启动子为AOX1。通过His+型Mut+筛选以及高拷贝整合筛选,获得重组菌P.pastoris GS115/p PIC9k-LHAase-His+-Mut+-4（P.pastoris/p PIC9k-LHAase-4）。利用5-L发酵罐高密度发酵重组菌P.pastoris/pPIC9k-LHAase-4来异源表达LHAase,在甲醇恒速流加条件下,发酵96小时LHAase酶活可达2.0×10~5U/mL。后续在5-L发酵罐中进行发酵条件优化,确定最佳种子液接种OD600 nm为50,甲醇（诱导剂）最佳平均浓度为38.66 g/L,最佳溶氧反馈补料设置为30%,高密度发酵96小时酶活可达7.11×10~5U/m L,相比于发酵条件未优化之前,提升255.5%。对LHAase进行透明质酸水解研究,在pH=5.5,温度37℃最适条件下,每1×10~5U的LHAase可在15 min内水解0.1 g的透明质酸,透明质酸平均分子量由2.0×10~6Da降至2408 Da。