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目的:年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）是世界范围内老年人群不可逆性致盲的主要原因之一。AMD分为干性和湿性两种类型,玻璃体腔内注射抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）药物的发现为湿性AMD的治疗取得了突破性进展,但对于干性AMD,目前尚未存在有效的治疗手段,但有几种药物正在临床试验中进行研究。干性AMD主要发病机制包括视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）氧化损伤。因此,阐明RPE细胞在生理和病理条件下抗氧化损伤的机制,寻找可以减轻视网膜氧化损伤的遗传或药物制剂将为延缓干性AMD的进展提供可能的治疗方式。Keap1/Nrf2信号通路是人体内重要的抗氧化信号通路,Nrf2通过与其下游基因的抗氧化反应元件（anti-oxidant response element,ARE）结合,介导机体抗氧化反应。此外,低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）是体内调控氧水平的另一重要转录因子,HIF-1α通过与其下游基因的缺氧反应元件（hypoxia response element,HRE）结合进而对机体氧化还原稳态进行调节。既往研究表明,一些非编码RNA或药物性Nrf2激动剂能够通过激活Nrf2/HIF-1α信号通路减轻机体氧化损伤。本课题组既往研究已经证实miR-125b能够通过减轻晶状体上皮细胞凋亡而延缓年龄相关性白内障的病程进展,明确了miR-125b在年龄相关性眼病中的调控作用。因此,本研究着力于探讨miR-125b能否通过靶向调控Nrf2/HIF-1α信号通路减轻视网膜氧化损伤,为AMD提供一种新的治疗策略。方法:（1）利用H2O2构建视网膜色素上皮细胞的氧化应激模型:用3%H2O2处理视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞系24h,用CCK-8实验检测细胞活性,选择细胞活性为50%时的H2O2浓度并命名为H2O2组,正常培养的RPE细胞作为对照组（control组）。分别提取两组细胞的总RNA和蛋白,采用qPCR方法检测miR-125b的表达改变;采用qPCR和western blot方法从mRNA和蛋白水平检测Keap1、Nrf2、HO-1和HIF-1α的表达。（2）验证miR-125b与Keap1之间的结合位点:构建Keap1野生型和突变型质粒,利用Lipofectamine TMRNAi MAX将miR-125b模拟物（mimic）和模拟物对照（mimic NC）与Keap1野生型和突变型质粒共转染至ARPE-19中,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光强度。（3）检测miR-125b对Nrf2/HIF-1α信号通路的调控作用:将miR-125b mimic,mimic NC,inhibitor,inhibitor NC转染至ARPE-19细胞,利用qPCR实验检测miR-125b转染效率。分别提取各组细胞的总RNA和蛋白后检测各基因的表达改变。（4）检测miR-125b对视网膜色素上皮细胞氧化应激反应的影响:ARPE-19细胞中转染miR-125b mimic,mimic NC,inhibitor,inhibitor NC,24-48小时后,采用SOD试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒、MDA试剂盒检测各组细胞氧化应激水平,采用EdU试剂盒检测各组细胞增殖活性。分别提取各组胞浆和胞核蛋白质,利用western blot方法检测Nrf2蛋白在胞浆和胞核中的表达改变,通过免疫荧光实验明确Nrf2蛋白核移位。（5）检测miR-125b影响RPE细胞氧化应激的作用机制:将si-Nrf2和si-NC转染至ARPE-19细胞,抑制细胞中Nrf2表达,分别提取各组细胞的总RNA和蛋白后检测各基因的表达改变。将miR-125b mimic,mimic NC,inhibitor,inhibitor NC与si-Nrf2和si-NC共转染至ARPE-19细胞,分别提取各组细胞的总RNA和蛋白后检测各基因的表达改变,利用SOD试剂盒、活性氧检测试剂盒、MDA试剂盒检测各组细胞氧化应激水平。（6）体内实验检测miR-125b通过Nrf2/HIF-1α信号通路调控小鼠年龄相关性黄斑变性:利用C57BL/6J小鼠与全身性Nrf2基因敲除小鼠,尾静脉注射高碘酸钠（NaIO3,50mg/kg）,14天后分离小鼠眼球视网膜色素上皮层,提取总RNA和蛋白质,检测相关基因表达改变。制作石蜡切片,利用H＆E染色实验检测视网膜各层厚度。结果:（1）与对照组相对比,H2O2组中miR-125b表达明显下调,Nrf2、HO-1表达显著下降,Keap1、HIF-1α表达显著上升,说明该模型中细胞Nrf2/HIF-1α信号通路功能损伤。（2）双荧光素酶报告基因系统结果发现,共转染miR-125b mimic与野生型Keap1 3’-UTR组荧光活性明显低于其他组,说明miR-125b能通过靶向抑制Keap1而调控Nrf2信号通路。除此之外,western blot结果显示转染miR-125b mimic组Keap1蛋白表达明显减少,而在mRNA水平则无明显改变,进一步说明miR-125b能够通过靶向抑制Keap1蛋白表达调控Nrf2信号通路,从而调控细胞抗氧化反应能力。（3）与转染miR-125b mimic NC组相比,转染miR-125b mimic组细胞核中Nrf2表达明显升高,且细胞中SOD含量增加,ROS和MDA均减少,说明miR-125b能够通过促进Nrf2核移位调控RPE细胞抗氧化反应能力。除此之外,EdU检测结果显示转染miR-125b mimic组细胞活性明显升高,说明miR-125b能够促进细胞活性。（4）用si-Nrf2抑制Nrf2表达后,与转染mimic NC组相比,转染miR-125b mimic组中促进细胞抗氧化能力的作用减弱或消失,进一步说明miR-125b对细胞抗氧化能力的调控通过Nrf2信号通路进行。（5）体内实验结果显示,尾静脉注射NaIO3后,miR-125b表达降低,Nrf2及其下游基因HO-1在mRNA和蛋白水平表达均减少,Keap1在mRNA水平无明显变化,在蛋白水平略有降低,HIF-1α在mRNA和蛋白水平表达均升高。此外,HE染色表明NaIO3处理后,视网膜厚度变薄,表明NaIO3引起了视网膜损伤。结论:本研究表明miR-125b可能在年龄相关性黄斑变性的形成过程中起到重要作用。在氧化应激诱导的视网膜损伤模型中,miR-125b表达明显下调,而且Nrf2/HIF-1α信号通路明显受损。过表达miR-125b能够通过促进Nrf2蛋白的核移位而减轻细胞的氧化损伤,当Nrf2表达被抑制后,miR-125b的对氧化损伤的减轻作用也随之减弱。此外,在氧化应激诱导的视网膜上皮损伤模型中,由于ROS水平的增加导致HIF-1α表达上调,而过表达miR-125b能够抵消这种上调,进一步说明miR-125b通过调控Nrf2/HIF-1α信号通路减轻视网膜色素上皮细胞氧化损伤。因此,miR-125b可能为干性年龄相关性黄斑变性的诊断和治疗提供了一个新靶点。