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目的：肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一,广西地区发病率更是高居中国的首位。近年来,基于肿瘤干细胞理论提出肿瘤治疗新型理念并广泛的在多种实质细胞和动物的体内展开实验研究。越来越多的证据支持肿瘤异质性的存在,而肿瘤干细胞为其根源。肿瘤干细胞来源于肿瘤细胞内一群数量极少量生长极度旺盛,有着强大的自我更新、无限增殖化分化、潜能、高度致成瘤性的细胞。此类细胞在肿瘤的发生、发展过程以及肿瘤治疗后的复发、对放化疗的耐药等方面,都起到了极为重要的作用。而在肿瘤细胞中其他的多数细胞不具备无限增殖潜能,几乎遵循的是短暂的分化成熟以后,最终发展为死亡的过程。我们认为肝癌细胞中也存在着这样一群肝癌干细胞,通过无血清悬浮成球培养,流式细胞技术能够筛选出肝癌干细胞,并进一步探讨PI3K/AKT信号通路对肝癌细胞系MHCC97L中CD90(Thy-1)阳性亚群细胞比例及干细胞特性的影响。方法：1.采用完全培养基和无血清培养基加入相关生长因子培养肝癌细胞系MHCC97L,分别进行贴壁和悬浮成球培养,收集相应细胞进行后续实验。2.糖原染色方法检测细胞球来源。3.流式细胞技术(flow cytometry)检测MHCC97L细胞系中贴壁细胞和悬浮成球细胞流式抗体CD90的表达量。4.贴壁培养和悬浮成球培养细胞分别经PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002处理后,流式细胞技术检测CD90表达量的变化。5.MTT法检测LY294002分别处理CD90+亚群细胞和CD90亚群细胞前后,两组细胞的增殖率变化。6.qRT-PCR检测LY294002分别处理CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞前后,其肝癌干细胞相关基因CD90,SHP2的表达量的变化7.Western blot检测CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞经LY294002处理前后肝癌干细胞相关蛋白以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。8.平板克隆实验检测LY294002对CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞克隆形成能力的影响。9.比较不同浓度梯度的CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞裸鼠皮下成瘤能力,以及LY294002处理后成瘤能力的变化情况。10.免疫组织化学法检测CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞所形成的裸鼠皮下瘤中肝癌干细胞相关蛋白和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量；以及经LY294002处理后相应蛋白表达量变化情况。结果：1.肝癌细胞系MHCC97L细胞在完全培养基中贴壁培养约5天可以稳定传代；在无血清培养基悬浮成球培养约7-9天可以稳定传代。2.糖原染色可说明细胞球来源于肝癌细胞。3.流式细胞仪检测结果表明肝癌干细胞标志物CD90在成球培养细胞中的表达量高于在贴壁培养细胞中的表达量(P<0.01)。4.经PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002处理后,流式细胞技术检测CD90-亚群细胞CD90表达量下降较CD90-亚群细胞明显(P<0.05)。5.CD90+亚群和CD90-亚群的细胞中,MTT法检测CD90+亚群细胞增值率变化较CD90’亚群细胞明显。6.加入LY294002抑制剂后,qRT-PCR检测CD90+亚群细胞中肝癌干细胞相关基因CD90、SHP2的表达量较未加入LY294002前表达量明显下降(P<0.05)；CD90-亚群细胞表达量变化不明显。7.加入LY294002抑制剂后,Western blot检测CD90+亚群细胞中的肝癌干细胞相关蛋白CD90、SHP2的表达量下降明显(P<0.05)。PI3K/AKT信号通路的下游特异性蛋白P-AKT的表达量下降(P<0.05);AKT蛋白表达量无明显变化。8.CD90-亚群细胞和CD90-亚群细胞克隆形成率分别为(93.13±4.72)%、(20.59±3.23)%,CD90+亚群细胞克隆形成率明显高于CD90-亚群细胞。CD90+亚群细胞和CD90-亚群细胞加入LY294002后,克隆形成率分别为(51.32±6.27)%、(18.37±3.21),CD90+亚群细胞克隆形成率显著降低魂(P<0.05),而加入LY294002对CD90-亚群细胞克隆形成率无明显影响(P>0.05)。9.相同细胞个数下,CD90+亚群细胞裸鼠皮下成瘤能力明显高于CD90-亚群细胞成瘤能力。10.CD90蛋白和SHP2蛋白在CD90+亚群细胞未加药时表达明显强于CD90+亚群细胞加抑制剂LY294002后的表达量；CD90-亚群细胞未加药的表达量与加药后变化不大。经LY294002处理后,CD90+亚群细胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、P-AKT蛋白表达量均较对照组明显减少,AKT蛋白表达量无明显变化；CD90-亚群细胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、 P-AKT、AKT蛋白表达量无明显变化。结论：无血清的条件培养基能较好的富集有肝癌干细胞特性的细胞亚群,流式分选MHCC97L细胞系所获得的CD90+亚群细胞具有干细胞特性,CD90+亚群细胞的干细胞特性受PI3K/AKT信号通路调节,这为进一步研究肝癌干细胞的特性及针对肿瘤干细胞的靶向治疗提供相关依据。