目前,作为新一代治疗方法的基因治疗和核酸疫苗进展迅速,显示出了广阔的应用前景,质粒DNA 作为基因治疗和核酸疫苗的常用载体被广泛应用,但是由于质粒DNA 转染效率相对较低,因而治疗对质粒DNA 的需求量很大。大规模制备质粒DNA 技术对基因治疗和核酸疫苗的应用和发展是必须的。传统实验室提取质粒DNA 的碱裂解法在放大规模制备时,会遇到很多难以克服的困难。本研究的目的是对质粒DNA 的提取方法进行优化和改进,以适应大规模生产的需要。以本实验室研制的口蹄疫核酸疫苗pcD3-VP1 为材料,从发酵菌种选择,发酵条件优化,细胞裂解方法创新等方面,摸索出一套成本低、效果好的大规模提取质粒DNA 的方法,为口蹄疫核酸疫苗的大规模应用奠定基础。一种实践上可行,成本低廉,高效的质粒DNA 的制备工艺对以质粒DNA 为药物的产业化具有十分重要的实践意义。首先,选择合适的发酵工程菌对于质粒的制备非常重要,因为质粒DNA在不同宿主菌中的状况不同。将重组质粒pcD3-VP1 分别转化工程菌DH5α、JM109、TOP10、XL1-blue,在相同的条件下进行培养后,比较质粒在不同宿主中的保有率。分别提取质粒,比较质粒在四种工程菌中的产量,结果TOP10 菌株对于重组质粒pcD3-VP1 的保有率最高,提出的质粒产量也最高。因此,选择TOP10 菌株作为大规模发酵的工程菌。确定了质粒和宿主菌之后进行高密度发酵,就是要得到大量含有质粒DNA的细菌。不同成分的培养基对细菌的生长和质粒的复制会产生不同的影响。营养补料策略是大肠杆菌高密度发酵成功的关键。实验中分别使用了4种发酵培养基,并运用3种不同的补料流加方式对重组TOP10 菌株进行发酵,比较细菌生长状况和质粒产量,结果发现培养基的碳源、氮源配比以及发酵进程中营养成分浓度对细菌的生长和质粒的产量极为重要。使用不同的培养基发酵得到的菌