近些年,转基因技术发生了迅猛的发展,为了快速提高经济动物的生产性能,科学家们制备了越来越多的转基因动物。通过转入外源基因改变生产性能的转基因动物是否会对生态环境和人类健康造成威胁,这一问题在科学界和社会上一直存在这比较大的争议。因此,全方位多角度的对未上市的转基因动物进行安全性评价,对人类社会的和谐发展以及生态环境的稳定具有重要的意义。本实验室前期通过体细胞核移植技术,成功的制备了提高奶产量的转生长激素(growth hormone,GH)基因奶山羊。本试验以转GH基因奶山羊为研究目标,从自身安全、环境安全和食品安全角度来评价其安全性。首先,通过高通量转录组测序技术比较泌乳期的转GH基因奶山羊和非转基因奶山羊乳腺的基因表达水平,来评价转GH基因奶山羊的自身安全性;然后,采集转GH基因奶山羊的粪便和肠道内容物以及转基因羊场内环境土壤为样本,检测样品中样品基因组中外源基因GH和neo的漂移情况,进而通过PCR-DGGE方法分析样品中菌群结构,进行转GH基因奶山羊的环境安全性评价;最后,通过饲喂SD大鼠来评价转GH基因羊奶的食品安全性,主要检测了转GH基因羊奶对SD大鼠的生长发育、免疫水平以及行为状态的影响。主要试验分为以下四个阶段:1转GH基因奶山羊泌乳期乳腺基因表达水平的变化转基因动物的安全性评价体系中,对转基因动物自身安全的评价是重要的一环,这关系到转基因动物制备成功与否的关键。转GH基因奶山羊转入的是乳腺特异性表达的山羊生长激素基因,因此转基因山羊乳腺发育的变化是否会对动物体的健康造成隐患,需要进一步的研究。本试验通过转录组测序方法,比较转GH基因奶山羊泌乳期乳腺组织基因水平与非转基因奶山羊的差别。并选择15个与生长激素影响乳腺发育相关的基因,通过qRT-PCR方法进一步验证。结果表明,转GH基因奶山羊乳腺中过表达的生长激素虽然能够促进乳腺细胞的过量增殖,但是动物机体通过自身的调节可以将乳腺的增殖保持在健康水平,证明了转GH基因奶山羊能够健康的生长发育。2转GH基因奶山羊外源基因漂移检测在评价转基因动物安全性的过程中,环境安全性评价是必不可少的一环,而外源基因漂移的检测又是环境安全性评价的重中之重。本部分试验的研究目的是通过PCR扩增反应对转GH基因奶山羊的肠道内容物、粪便和环境土壤中细菌基因组进行检测,以确定是否发生基因漂移事件。首先,分别采集转生长激素奶山羊和非转基因奶山羊的肠道内容物和粪便以及羊场内部和附近的土壤作为样品,然后利用商业化的基因组提取试剂盒提取样品中存在的细菌基因组,在针对制备转GH基因奶山羊的载体设计检测引物,最后通过PCR扩增反应验证样品基因组中是否存在外源基因。检测的结果显示,转GH基因奶山羊的肠道内容物样品、粪便样品以及环境土壤样品中的细菌基因组均未检测到外源的山羊生长激素基因以及neo基因。这些结果证明了,转GH基因奶山羊外源基因整合状态稳定,没有发生基因漂移事件。3转GH基因奶山羊对环境菌群结构的影响转基因动物在养殖生产阶段是否会对周围环境物种造成影响一直是社会和科学界关注的焦点,而评价周围环境菌群结构是转基因动物环境安全性评价的重要指标。本研究的目的是评价转GH基因奶山羊对周围环境菌群结构的影响。首先通过PCR扩增方法得到转GH基因奶山羊的粪便、肠道内容物和环境土壤样品中细菌基因组的16srDNA基因V3区域片段;然后通过PCR-DGGE方法将不同序列的DNA片段分离,并将分离出来的条带进行回收纯化;最后将回收的DNA片段进行测序,并提交到GenBank数据库进行Blast比对,得到细菌种属信息。PCR-DGGE电泳相似性数据分析表明,各类样品的相似度在95%以上;各样品的菌群种属统计数据显示,各样品的优势菌群相同,整体菌群机构分布趋势一致。这些结果表明,转GH基因奶山羊的存在,对其生存空间存在的微生物菌群结构并没有造成显著性的差异。从环境安全性方面考虑,转GH基因奶山羊并没有展现出破坏环境中生物多样性的特性。4转GH基因羊奶食品安全性评价在评价转基因动物安全性时,转基因动物产生的食品同样要进行安全性评价。因此,本试验通过饲喂动物试验来评价转GH基因奶山羊产出的羊奶的食品安全性。本试验将60只大鼠分成三组,分别饲喂转GH基因羊奶、正常羊奶以及生理盐水,饲喂周期为90天。饲喂期间每天观察记录大鼠的生活习性,并定期称量体重;采集各组大鼠的血液样品进行血常规检测和血清生化检测;用ELISA试剂盒检测血清中免疫相关指标IL-2、IgG、IgE和IFN-γ的水平;90天后对大鼠进行剖检,对主要脏器进行称重以及组织病理切片观察。各项检测结果显示,转GH基因羊奶对大鼠生长发育情况的影响与正常羊奶没有差异,在一定程度上证明了转GH基因羊奶的食品安全性。