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NLRP3炎症小体是由模式识别受体NLRP3、接头分子ASC和pro-caspase-1构成的大型胞质蛋白复合体;能够识别病原感染和细胞内的危险信号后活化,诱导细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌,并导致细胞发生焦亡。NLRP3炎症小体在抗感染、炎症、阿尔兹海默症以及癌症等多种疾病中扮演了重要的角色。因此,揭示NLRP3炎症小体活化及调控机制,对于阐明炎症异常活化的相关疾病的发生、发展的机理,进而提出针对性的防治策略有重要意义。多种蛋白质翻译后修饰,比如磷酸化和泛素化等,能够通过影响NLRP3的蛋白水平,来严密调控NLRP3炎症小体的活化过程。为了进一步揭示蛋白质翻译后修饰在维持NLRP3蛋白水平和NLRP3炎症小体活化中的作用,我们利用免疫共沉淀结合液相质谱分析,在小鼠腹腔巨噬细胞中筛选能与NLRP3特异性结合的分子;发现E3 SUMO连接酶TRIM28可与NLRP3结合。TRIM28是TRIM家族第Ⅵ亚家族成员,具有E3 SUMO连接酶活性,可以介导PCNA和Vps34等分子的SUMO化。SUMO化是一种类泛素化蛋白质翻译后修饰,通过E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶的三种酶级联反应实现。哺乳动物各个组织中都含有三种SUMO分子,分别是SUMO1,SUMO2和SUMO3在三种SUMO分子中,SUMO1只能以单个的形式连接到靶蛋白的赖氨酸残基上,而SUMO2和SUMO3不止可以以单个的形式进行修饰,还可以以多聚链状连接到靶蛋白上。SUMO化是一个动态可逆的过程,去SUMO化蛋白酶可以将SUMO分子从靶蛋白上切除,使靶蛋白发生去SUMO化。已有报道发现NLRP3的SUMO化在炎症小体活化过程中发挥着重要作用。E3 SUMO连接酶MUL1介导NLRP3发生SUMO2/3形式的SUMO化并抑制NLRP3炎症小体的活化,而去SUMO化酶SENP6/7可以去除NLRP3 SUMO化修饰并促进NLRP3炎症小体的活化;NLRP3的SUMO1形式的SUMO化可以促进NLRP3炎症小体活化,而去SUMO化酶SENP3可以去除NLRP3 SUMO1修饰。然而,NLRP3的SUMO化调控NLRP3炎症小体的具体机制,以及介导NLRP3 SUMO1形式的SUMO化的E3 SUMO连接酶仍是未知的。本研究旨在研究和探讨E3 SUMO连接酶TRIM28在NLRP3炎症小体活化中的调控作用及其作用的分子机制;阐明NLRP3炎症小体活化过程中NLRP3 SUMO化与泛素化修饰的相互作用,进一步揭示NLRP3炎症小体的活化调控机制。首先,我们利用小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和HEK293T细胞分别进行了免疫荧光、免疫共沉淀和免疫印迹实验,证实TRIM28可以与NLRP3特异性结合而不与NLRP3炎症小体的其他组分结合。接下来,利用Trim28基因条件性敲除小鼠及转染Trim28小干扰RNA的小鼠腹腔巨噬细胞,通过免疫印迹及RT-PCR实验明确了TRIM28不影响NLRP3炎症小体活化的引发阶段。随后,我们通过ELISA和免疫印迹实验发现当Trim28基因敲除后体内和体外的NLRP3炎症小体的活化均明显减弱。而利用Trim28基因条件性敲除小鼠、转染Trim28小干扰RNA的小鼠腹腔巨噬细胞和HEK293T细胞,以及蛋白质合成的抑制剂CHX、泛素蛋白酶体途径的抑制剂MG132、自噬的抑制剂氯喹（chloroquine）和溶酶体途径抑制剂3-MA,通过免疫印迹实验发现TRIM28可以抑制NLRP3的蛋白酶体途径的降解,从而稳定NLRP3的蛋白表达。进一步,利用Trim28基因条件性敲除的小鼠和HEK293T细胞,通过转染质粒和免疫印迹实验发现TRIM28可以抑制NLRP3的K48位偶联的泛素化并不影响K63位偶联的泛素化。在此基础上,我们构建了一个TRIM28 E3 SUMO连接酶酶活失活的点突变质粒TRIM28-C651A,通过在HEK293T细胞转染质粒并进行免疫共沉淀和免疫印迹实验后发现TRIM28-C651A点突变质粒失去了与E2 SUMO结合酶UBC9结合的能力,从而证实了 TRIM28 C651A点突变后其E3 SUMO连接酶酶活失活,且TRIM28-C651A点突变使其缺失了抑制NLRP3泛素化和降解的能力,明确了 TRIM28通过其E3 SUMO连接酶活性特异性的抑制了 NLRP3的K48位偶联的泛素化以及NLRP3的降解。最后,我们利用Trim28基因条件性敲除的小鼠、转染Trim28小干扰RNA的小鼠腹腔巨噬细胞和HEK293T细胞,通过免疫共沉淀、转染质粒和免疫印迹等实验方法,发现TRIM28可以促进小鼠腹腔巨噬细胞和HEK293T细胞中NLRP3的SUMO1、SUMO2和SUMO3三种形式的SUMO化修饰,且TRIM28 C651A点突变使其失去了介导NLRP3的SUMO化的能力。综上,本研究阐明了 E3 SUMO连接酶TRIM28在NLRP3炎症小体的活化中的作用,并揭示了 TRIM28通过促进NLRP3发生SUMO化修饰、抑制其泛素化降解,从而促进NLRP3表达的分子机制。本研究揭示了 SUMO化修饰调控NLRP3蛋白水平和炎症小体活化的机制,发现了 NLRP3的两种蛋白翻译后修饰（SUMO化和泛素化）在调控NLRP3炎症小体活化中的相互作用;在此基础上,为NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的防治提供了新的潜在靶点。