【摘 要】
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目的芪冬宁方是本课题组应用随机森林算法对上市中成药-金复康口服液二次优化筛选出的具有抗肺癌效果的中药复方。本研究从自噬的调控角度,通过体内体外研究,探索芪冬宁方调控自噬抗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）增殖及转移的效应及机制。方法1.芪冬宁方对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的体外研究。应用CCK-8法,检测干预48h后,不同浓度的芪冬宁方对非小细胞肺
【基金项目】
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院级课题（KY111.30.77）:金复康优化方调节ROS诱导肺癌细胞DNA损伤和衰老的机制研究；
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目的芪冬宁方是本课题组应用随机森林算法对上市中成药-金复康口服液二次优化筛选出的具有抗肺癌效果的中药复方。本研究从自噬的调控角度,通过体内体外研究,探索芪冬宁方调控自噬抗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）增殖及转移的效应及机制。方法1.芪冬宁方对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的体外研究。应用CCK-8法,检测干预48h后,不同浓度的芪冬宁方对非小细胞肺癌系A549、NCI-H460细胞增殖的影响;应用划痕实验、迁移实验、侵袭实验,观察干预48h后,不同浓度的芪冬宁方对A549、NCI-H460细胞迁移侵袭能力的影响;2.芪冬宁方对裸鼠NCI-H460皮下移植瘤模型及转移模型的体内研究。通过构建裸鼠NCI-H460皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为对照组和芪冬宁方组,分别给予纯水、芪冬宁方灌胃,监测瘤体的生长,干预33天后,取瘤组织,Western Blot法检测芪冬宁方对皮下移植瘤瘤体组织LC3B、p62的影响;通过构建NCI-H460裸鼠肺转移模型,将裸鼠随机分为对照组、芪冬宁方低剂量组,芪冬宁方高剂量组,分别给予纯水、芪冬宁方低剂量、芪冬宁方高剂量灌胃,干预21天后,取肺组织,进行HE染色,观察肺内转移瘤的变化;3.芪冬宁方对NSCLC细胞自噬的体内外研究。取裸鼠皮下移植瘤,Western Blot法检测各组自噬相关相关蛋白LC3B、p62;电镜下观察A549、NCI-H460细胞超微结构;Western Blot法检测芪冬宁方对LC3B、p62、LAMP1、CTSB、CTSD等自噬相关蛋白的影响;应用免疫荧光法及激光共聚焦技术观察芪冬宁方对A549、NCI-H460细胞中自噬流的影响;4.芪冬宁方调控的自噬对NSCLC细胞增殖及转移的体外研究。应用自噬抑制剂氯喹、自噬激动剂雷帕霉素及RNA干扰技术敲低自噬相关蛋白BECN1的表达,观察芪冬宁方诱导的自噬在A549、NCI-H460增殖、迁移及侵袭中的效应的变化;结果1.体外研究表明:芪冬宁方可以抑制A549、NCI-H460细胞增殖,呈剂量依赖性;芪冬宁方能抑制A549、NCI-H460的迁移、侵袭;2.体内实验结果表明:应用裸鼠NCI-H460皮下移植瘤模型,与对照组相比,芪冬宁方可以抑制NCI-H460皮下移植瘤的生长;应用裸鼠NCI-H460肺转移模型,与对照组相比,芪冬宁方组肺内转移灶个数无统计学差异,HE结果提示:芪冬宁方可以延缓肺转移的进程;3.体外研究表明:芪冬宁方能上调LC3B的表达,呈浓度及时间依赖性,下调p62的表达,呈时间依赖性,能上调LAMP1、CTSB、CTSD的表达,呈时间依赖性,能下调CTSB的表达,呈浓度依赖性;荧光结果显示,芪冬宁方促进LC3B的累积,呈斑点状聚集在细胞核周,且GFP-LC3B未被降解;芪冬宁方抑制LC3B与LAMP1重合;体内研究表明:应用裸鼠NCI-H460皮下移植瘤模型,与对照组相比,芪冬宁方可以上调NCI-H460皮下移植瘤LC3B的表达,下调p62的表达;4.体外研究表明:敲低BECN1后,芪冬宁方抑制A549、NCI-H460增殖的能力减弱;敲低BECN1后,芪冬宁方抗A549细胞迁移侵袭能力减弱,抗NCI-H460细胞迁移侵袭能力增强;5.体外研究表明:自噬抑制状态下,芪冬宁方抑制A549、NCI-H460增殖能力减弱,抑制迁移能力增强;自噬激活状态下,芪冬宁方抑制A549、NCIH460增殖的能力减弱,抑制迁移侵袭能力增强;结论1.芪冬宁方抑制NSCLC细胞生长和转移;2.芪冬宁方通过抑制NSCLC细胞自噬体与溶酶体结合及破坏溶酶体功能抑制自噬流;3.芪冬宁方调控的自噬对NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭有影响;
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