植物络合素(PCs)在生命有机体金属离子平衡、解毒和转运累积体系中扮演着重要角色并有着广泛的应用前景,对其编码基因的挖掘及功能探究已成为生物学领域的一个研究热点。孔雀草(Tagetes patula L.)为万寿菊属一年生草本植物,在观赏、园林绿化以及药用等方面被广泛应用。本研究对孔雀草PCS基因cDNA全长克隆,揭示镉胁迫下PCS基因的表达模式和功能,为探明孔雀草镉胁迫的分子响应机制提供理论依据。已取得研究结果如下:1.孔雀草PCS基因的克隆:通过同源引物扩增方法获得一保守区序列,该序列长为311bp,BLAST发现该段保守序列跟苣买菜(Sonchus arvensis)(SaPCS1)和莴苣(Lactuca sativa)(LsPCS1)的相似性很高,达90%。以该保守序列设计引物,利用cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,对孔雀草PCS基因保守区序列分别进行3′RACE和5′RACE扩增,由此获得3′端序列1401bpb和5′端序列568bp,利用MEGA6.0软件对序列进行拼接,最终获得雀草PCS基因全长cDNA序列,基因全长1970bp。对序列进行开放阅读框(ORF)分析表明:基因编码区长1764bp,编码587个氨基酸。将该序列上传至NCBI中并命名为孔雀草PCS1(TpPCS1)基因,登录号为KY007159。2.孔雀草PCS基因的生物信息学分析:用DNAman软件对TpPCS1基因进行生物信息学分析,结果显示:TpPCS1基因全长1970bp,开放阅读框(ORF)长度为1764bp,编码587个氨基酸,N端含9个半胱氨酸(Cys),具有34个酶切位点;基因编码蛋白分子量为65.23KDa,等电点为8.01,不稳定系数为47.72,平均疏水性指数为-0.171,该蛋白为亲水性不稳定蛋白;基因编码蛋白信号肽预测结构显示该蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白,且跨膜预测结果显示该蛋白不存在跨膜区,二者与功能域预测结果相符合,属于植物络合素合酶蛋白,功能为细胞内重金属镉螯合剂;基因编码蛋白二级结构显示蛋白属于mixed型,以螺旋和转角为主,与三级结构预测结果比较,二者结果吻合;从系统进化树中可以看出,TpPCS1基因在进化上与同属植物苣买菜和莴苣关系较近。3.TpPCS1基因的表达分析:对不同Cd浓度胁迫TpPCS1基因相对表达量研究,以孔雀草18srRNA和莴苣β-actin mRNA做内参,结果显示:(1)相同镉浓度胁迫下,根中TpPCS1基因表现出较高的表达量,叶和种子中TpPCS1基因表达量相对较低,产生这一结果的原因可能与不同器官对镉的富集量有关,通常情况下,根中的镉含量较其他器官都高;(2)相同生长期,随着镉胁迫浓度的上升,植株根、茎、叶中TpPCS1基因的表达量均呈上升趋势,而在种子中,TpPCS1基因的表达量呈下降趋势;(3)同一器官,随着镉胁迫时间增长,根、茎中TpPCS1基因的表达量均表现上升趋势,其中根中表现明显,而在叶中TpPCS1基因的表达量在低浓度时表现出高表达,而高浓度时表达量有所减少。4.不同浓度镉胁迫对孔雀草DNA甲基化的影响:利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,对不同浓度Cd胁迫下孔雀草基因组DNA甲基化变化情况进行分析研究,结果表明:经0、50、250和500 mg·kg-1浓度Cd处理后,基因组MSAP比率分别为24%、30%、35%和41%,全甲基化率分别为20%、23%、25%和27%,这表明重金属胁迫处理后,DNA总甲基化水平随Cd浓度升高而呈上升变化趋势;在DNA甲基化模式变化方面,50、250和500 mg·kg-1浓度胁迫下重新甲基化率分别为10%、10%和11%,重新甲基化为主要的甲基化变化模式。