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目的检测铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）上清液诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）凋亡过程中Krupple-like因子6（Krupple-like factor 6,KLF6）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）的表达水平,探讨KLF6及iNOS在此凋亡过程中作用及机制。方法MTT法检测细胞增殖率筛选出适宜的浓度和作用时间,PA上清液根据浓度的不同分为对照组（加入等容积的完全培养基）,15%PA组、30%PA组、45%PA组(PA浓度[1]为PA上清液与完全培养的体积比),分别作用12h、24h。另设SMT（-）组（不加SMT）、SMT（+）组（SMT为iNOS阻断剂,浓度根据说明书和预实验结果选取6μM）,根据MTT结果选取30%PA上清液作用细胞24h作为处理条件。流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,Western blot检测KLF6、iNOS蛋白的表达情况,荧光定量PCR检测KLF6 mRNA、iNOS mRNA的表达水平,NO含量检测试剂盒检测NO含量,用SPSS16.0软件进行数据分析。结果1、MTT结果显示,RAW264.7的增殖率随着PA上清液浓度的增加而增加,随着作用时间的延长而增加,筛选出后续实验的作用时间是12h、24h。同浓度PA上清液作用12h、24h时,细胞增殖率随着作用时间的延长而升高,差异有统计学意义（P<0.05）。不同浓度PA上清液处理相同时间时,细胞增殖率随着浓度的增加而升高,差异有统计学意义（P<0.05）。说明PA上清液对RAW264.7细胞有增殖抑制作用,且抑制效应呈时间-浓度依赖性。2、流式细胞仪检测结果显示,RAW264.7细胞与不同浓度的PA上清液作用24h后,与对照组相比,RAW264.7的凋亡率随着PA上清液浓度的增加而增加,差异有统计学意义（P<0.05）。PA上清液可诱导RAW264.7细胞的凋亡,且呈浓度依赖性。3、经Hoechst 33342染色后,对照组RAW264.7细胞的细胞核呈蓝色圆形或椭圆形,染色体均匀一致;经不同浓度的PA上清液处理RAW264.7细胞24h后,细胞核固缩,深染,核内可见浓染致密的块状颗粒,这些细胞核形态变化均为细胞凋亡的表现。其中以45%PA组上清液处理组最为明显,提示PA上清液诱导RAW264.7细胞凋亡呈浓度依赖性。4、Western blot结果显示,不同浓度的PA上清液分别感染RAW264.7细胞24h后,KLF6、iNOS蛋白表达均高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,KLF6、iNOS表达水平均明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。5、荧光定量PCR结果显示,不同浓度的PA组处理RAW264.7细胞24h后,细胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表达水平均高于对照组,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,细胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表达水平均高于对照组,且呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。6、NO含量检测结果示,不同浓度的PA组感染RAW264.7细胞24h后,细胞上清液中的NO含量随着PA上清液浓度的增加而增加,差异有统计学意义（P<0.05）。30%PA组感染RAW264.7细胞12h、24h后,细胞上清液中的NO含量随着PA上清液作用时间的延长而增加,差异有统计学意义（P<0.01）。7、SMT（+）组的细胞,经30%PA上清液处理24h后,与SMT（-）组相比,RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达水平有所降低（P<0.01）,差异有统计学意义。同时检测细胞上清液中的NO含量,与SMT（-）组相比,NO含量有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）。SMT阻断iNOS生成后,流式细胞仪检测PA上清液感染的RAW264.7细胞的凋亡率,与SMT（-）组相比,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。结论1、PA上清液能抑制RAW264.7细胞增殖,且其抑制效应呈浓度-时间依赖关系。2、PA上清液诱导RAW264.7细胞凋亡的机制可能是KLF6调控iNOS产生过量的NO诱导细胞凋亡。3、iNOS表达的减少对于PA上清液感染RAW264.7细胞引起的细胞毒性起到一定的保护作用。