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第一章：大鼠肺缺血/再罐注损伤模型制作方法的改进目的探索一种简易的制备大鼠肺缺血/再灌注损伤模型的方法。方法选用24只SPF级SD大鼠作为实验动物,体重250-300g,2%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉不满意时追加10mg/kg,麻醉后仰卧位固定,游离右颈总动脉,置入留置针。颈部气管切开插管,调节呼吸机参数,吸入空气,呼吸频率70次/min,潮气量15ml/kg,吸呼比12。24只SD大鼠随机分为2组：假手术组(Sham组,n=12)和肺缺血/再灌注组(I/R组,n=12)。A) Sham组：经左侧第6肋间开胸,不夹闭左侧肺门。B)I/R组：呼吸机辅助呼吸20min后右侧颈总动脉采血0.5ml作血气分析,注入普通肝素300U/kg,从左侧第6肋间剖开胸腔。待全身肝素化10min后,无创血管夹于吸气末期夹闭肺门,左肺无通气且肺门部血管无搏动为满意夹闭。夹闭肺门后再次调节呼吸参数,呼吸频率90次/分,潮气量10ml/kg,吸呼比为1：2。肺门阻断45min后,撤出无创血管夹,再灌注120min。开始再灌注后,膨肺使左肺完全复张,调节呼吸机参数,吸入空气,呼吸频率70次/min,潮气量15ml/kg,吸呼比1：2。制模期间每小时输入3ml/kg生理盐水,补充大鼠体液丢失,维持血流动力学平稳。呼吸机辅助呼吸20min和左肺再灌注120min时各采血0.5ml行血气分析。左肺再灌注120min后快速放血处死大鼠,取出肺组织,生理盐水冲洗肺表面血渍,吸干肺表面水分,肉眼观察左肺外观改变。切取左肺约1/3组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察肺组织病理结构。取左肺约1/3组织,滤纸吸干表面水分后称湿重,再将肺组织置入70℃考烘箱内烘烤72h称干重,计算出W/D值。统计方法：数据用均数±标准差(x-±s)表示,SPSS13.0统计学分析软件统计分析,独立样本t检验比较两组间的均数,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果预实验10只SD大鼠,麻醉过程均顺利,1只大鼠因颈动脉套管针脱出大出血死亡,1只大鼠因开胸后损伤左乳内动脉于肺门夹闭32min后出血过多死亡,1只大鼠因呼吸机出气管道异物不完全堵塞于肺门夹闭20min后死亡。正式实验24只大鼠均完成手术操作,顺利建模。呼吸机辅助呼吸20min, I/R组PaO2/FiO2值466.7.4±19.5,Sham组PaO2/FiO2值451.44±21.4,两组PaO2/FiO2差异无统计学意义(P>0.05)；肺组织再灌注120min, I/R组PaO2/FiO2值287.4±15.2,Sham组PaO2/FiO2值444.3±20.5,I/R组与Sham组比较,I/R组PaO2/FiO2值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。Sham组肺表面红润,无出血、水肿、出血点等改变。I/R组肺表面呈暗红色,肺充血、水肿明显,部分区域肺组织实质样改变,可见斑点状出血。Sham组肺泡结构完整,无肺间质增宽、炎性细胞渗出等异常改变。I/R组部分肺泡塌陷,肺泡间质水肿、间隔明显增宽,间隔内可见大量白细胞渗出、聚集,肺毛细血管扩张、充血,白细胞附壁。肺组织湿干比值(W/D)是反映肺毛细血管渗出及肺水肿程度的重要指标,Sham组W/D值4.26±0.22,I/R组W/D值6.26±0.36,I／R组与Sham组比较,W/D值显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论经大鼠左侧第6肋间,无创血管夹垂直夹闭左侧肺门,使肺组织缺血45mmin,再灌注120mmin,从肺泡.毛细血管屏障功能失调、肺生理功能减退、肺组织病理学改变三方面证实LIRI模型制备成功,本法能充分暴露肺门,可避免因游离肺门造成的血管及肺组织损伤,具有制模成功率高、操作简便等优点。第二章：大鼠肺缺血期双后肢缺血处理对肺缺血/再灌注损伤的保护作用目的观察大鼠肺缺血期双后肢缺血处理对肺缺血/再灌注损伤的作用。方法选用24只SPF级SD大鼠作为实验动物,体重250-300g,2%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉,不满意时追加10mg/kg,麻醉成功后仰卧位固定,颈部气管切开插管,机械通气,调节呼吸机参数,吸入空气,呼吸频率70次/min,潮气量15ml/kg,吸呼比1：2。24只SD大鼠随机分为3组：假手术组(S组,n=8)、肺缺血/再灌注组(I/R组,n=8)和肺缺血期肢体缺血处理组(RIP组,n=8)。A)S组：剖胸后不夹闭左侧肺门,观察165min。B)I/R组：无创血管夹夹闭左侧肺门45min,再灌注120min。C) RIP组：左肺缺血5min后,用束带阻断双后肢血供5min,再灌注5min,重复处理4次,其余步骤同I/R组。观察大鼠肺缺血期肢体缺血处理减轻肺组织氧化应激、炎症反应以及IκB-α表达的影响。动脉血气分析：呼吸机辅助呼吸20min(Ti)、左肺再灌注121min(T2)右颈总动脉采血作血气分析。肺湿干比(W/D)：吸干肺表面水分,称湿重,肺组织置入70℃烤烘箱内,烘烤72h,称干重,计算W/D值。肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定：肺组织制成5%匀浆,按MPO试剂盒说明书,用化学比色法测定肺组织MPO活性。肺组织SOD活性测定：肺组织制成10%匀浆,4℃下3000r/min离心10min,取上清液, 按SOD试剂盒说明书,用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。肺组织MDA含量测定：肺组织制成10%匀浆,4℃下3000r/min离心10min,取上清液,按MDA试剂盒说明书,用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量。肺组织TNF-α含量测定：肺组织制成10%匀浆,4℃下3000r/min离心10min,取上清液,按TNF-α试剂盒说明书,用双夹心ELISA法测定TNF-α含量。肺组织IL-6含量测定：组织制成10%匀浆,4℃下3000r/min离心10min,取上清液, 按IL-6试剂盒说明书,用双夹心ELISA法测定IL-6含量。肺组织IκB-α含量测定：取出部分冻存左肺组织,肺组织IκB-α含量用Western blotting测定。统计方法：计量资料以均数±标准差(x-±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析,配对t检验比较组内的均数,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用SNK检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果动脉血气分析结果：I/R组和RIP组T2点PaO2/FiO2值均较T1点低(P<0.05),IR组和RIP组T2点PaO2/FiO2值均较S组降低(P<0.05),而RIP组PaO2/FiO2值较I/R组升高(P<0.05),表明肢体缺血处理具有改善肺换气功能作用；T1点PaO2/FiO2、PaCO2值及T2点PaCO2值组间差异均无统计学意义(P>0.05)；各组T1点、T2点PaCO2值组内差异无统计学意义(P>0.05)；S组T1点PaO2/FiO2值比T2点稍高,差异无统计学意义(P>0.05)。湿干比值(W/D)结果：I/R组W/D值为6.20±0.32,S组W/D值为4.37±0.27,I/R与S组比较,肺组织W/D值显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RIP组W/D值为5.39±0.29,RIP组与I/R组比较,W/D值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性：I/R组MPO活性为4.30±0.22 U/g,S组MPO活性为1.48±0.08U/g, I/R与S组比较,肺组织MPO活性显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RIP组MPO活性为2.01±0.17 U/g, RIP组与I/R组比较,MPO活性显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织SOD活性：I/R组SOD活性为14.21±1.14U/mg, S组SOD活性为21.07±1.76U/mg, I/R与S组比较,肺组织SOD活性明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05). RIP组SOD活性为33.78±2.06 U/mg, RIP组与I/R组比较,SOD活性显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织MDA含量：I/R组MDA含量为1.32±0.09 nmol/mg,S组MDA含量为0.62±0.06 nmol/mg, I/R与S组比较,肺组织MDA含量显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RIP组MDA含量为0.81±0.05 nmol/mg, RIP组与I/R组比较,MDA含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织TNF-α含量：I/R组肺组织TNF-α含量为732.8±64.2 pg/mL,S组肺组织INF-α含量为229.0±28.3 pg/mL, I/R与S组比较,肺组织TNF-α含量显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RIP组肺组织TNF-α含量为443.8±41.3pg/mL,RIP组与I/R组比较,TNF-α含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织IL-6含量：I/R组肺组织IL-6含量为1380.0±113.4 pg/mL,S组肺组织IL-6含量为339.2±49.2 pg/mL, I/R与S组比较,肺组织IL-6含量显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05), RIP组肺组织IL-6含量为772.9±72.4 pg/mL,RIP组与I/R组比较,IL-6含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。I/R组IκB-α含量为0.12±0.02,S组IκB-α含量为0.37±0.03,I/R与S组比较,肺组织IκB-α含量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。RIP组IκB-α含量为0.34±0.04 U/mg,RIP组与I/R组比较,IκB-α含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠肺缺血期肢体缺血处理能抑制中性粒细胞聚集、抑制肺组织的炎症反应、提高抗氧化酶活性和增强氧自由基的清除能力,使氧化产物的生成减少,从而降低肺毛细血管通透性,减少肺水含量,提高肺换气功能,具有减轻肺缺血/再灌注损伤的作用。大鼠肺缺血期肢体缺血处理可能是通过抑制κB-α磷酸化降解,减少TNF-α和IL-6的表达,从而减轻肺缺血再灌损伤炎性反应。