第一部分AP患者TF改变对凝血系统的影响目的:动态监测急性胰腺炎患者凝血指标及TF和TF-MPs的变化,评价急性胰腺炎患者凝血系统的变化与TF的相关性,探讨TF作为AP早期微循环障碍的诊断指标的作用。方法:选取2013年5月-2014年5月在重庆医科大学附二院住院的急性胰腺炎患者80例。MAP组共有40例患者,男女分别为18和22例,患者中位年龄为(63.3±5.6)岁;SAP组同样为40例患者,男女分别为16和24例,中位年龄(64.2±6.8)岁;选取相同时间段在本院接受健康体检的40例正常老年人作为对照组(CON组),男20例,女20例,平均年龄(63±6.5)岁。入院之后第l、2、7天清晨空腹抽取外周静脉血,并对凝血指标进行检测,具体为:1)PT(凝血酶原时间);2)FIB(纤维蛋白原);3)APTT(凝血酶时间);4)D-D(D-二聚体),检测血浆中血淀粉酶及白细胞,ELISA监测血浆中TF的变化,流式细胞仪测定血浆中TF相关膜微粒含量。结果:第1和第2天,MAP组患者的PT、FIB、APTT以及D-D四项指标相较于对照组均有显著上升,差异性较为显著(P<0.05),第7天,该组患者上述几项指标和对照组患者较为接近(P>0.05)。第1,2和第7天,SAP组患者的PT水平相较于对照组患者有显著地上升,可见统计学差异(P<0.05).第1,2和第7天内,SAP组患者的PT、FIB、APTT、D-D以及BAMY等各项指标的上升幅度相较于MAP组均更明显,组间内有统计学差异(P<0.05)。采用ELISA法对血清中TF进行检测,结果得出:第1,2和7天三个时段中,MAP组患者的血清TF水平略微高出对照组患者,差异有显著性(P<0.05)。SAP组1,2,7天TF水平显著高于对照组,有显著性差异(P<0.01)。第1,2和第7天三个时段,SAP组患者的TF水平要比MAP组患者有较明显地上升,组间差异性较为明显(P<0.05)。根据流式细胞仪所得的检测结果:上述时段中,MAP组患者的TF-MPs水平相较于对照组患者有显著地上升,但程度较轻,相比差异性显著(P<0.05)。SAP组1,2,7天TF-MPs水平显著高于对照组,有显著性差异(P<0.01)。MAP组与SAP组两两比较,第1,2,7天SAP组TF-MPs水平均较MAP组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SAP患者的凝血和纤溶系统均受到不同程度的影响,TF和TF-MPs与患者的病情严重程度呈正相关,如果能够抑制TF和TF-MPs,推测对患者的凝血、纤溶功能均有一定的改善作用。通过平衡体内的微循环状态,可调节和改善急性胰腺炎的预后。第二部分Gd Cl3阻断KCs对AP状态下凝血系统的影响目的:观察大鼠急性胰腺炎TF和TF-MPs及凝血和纤溶系统的变化,探讨AP状态下KCs的TLR4和TF的表达对大鼠凝血和纤溶系统的影响。方法:使用SD大鼠共计168只,采用随机的方法将其分成7个组别,依次为:1)对照组;2)假手术(SO)组;3)SO+氯化钆(Gd Cl3)预处理组;4)轻型胰腺炎(MAP)组;5)重型胰腺炎(SAP)组;6)MAP+Gd Cl3组;7)SAP+Gd Cl3组。通过胰胆管逆行注射的方式对各组大鼠注射牛黄胆酸钠,浓度分别为1.5%,5%,从而建立起MAP和SAP模型。于手术结束后的第6 h、12 h和24 h这三个阶段对大鼠进行处死,对其血清中的凝血、白细胞、血淀粉酶的变化进行检测;ELISA法检测血清中TF水平;流式细胞仪检测TF-MPs的表达;分离培养KCs,采用Western Blot法对KCs细胞的TF、TLR4蛋白表达进行检测;采用Real-time PCR法对TF m RNA、TLR4 m RNA两项指标进行测定;根据病理切片,对大鼠肝脏和胰腺的病理损伤状况进行观察。通过免疫组化法对大鼠肝脏、胰腺组织的TF表达进行检测;结果:术后第6h、12 h和24 h这三个时段,对上述组别内大鼠的PT、FIB、APTT、D-D以及WBC值予以测定;3个时间点上,MAP组大鼠的PT、FIB以及APTT等各项指标监测值,相较于CON组、SO组大鼠均有所增加(P<0.05),MAP+Gd Cl3组PT、APTT、FIB、D-D以及WBC值等相较于MAP组均有所下降(P<0.05)。SAP组大鼠的PT、APTT以及D-D等检测值,相较于CON组、MAP组以及SO组这三个组别大鼠则有较为显著地延长(P<0.01),SAP+Gd Cl3组大鼠的上述指标检测值相较于SAP组则有显著地下降(P<0.01)。但SO组、SO+Gd Cl3组这两个组别内的大鼠,其PT、FIB、APTT、BAMY、WBC值均较CON组无明显差别(P>0.05)。ELISA测得大鼠血清中TF水平,在不同时间点上,MAP组大鼠的TF值相较于CON组、SO组这两组大鼠,则有显著地上升(P<0.05),但MAP+Gd Cl3组大鼠该指标则要显著低于MAP组大鼠(P<0.05)。SAP组大鼠的TF值相较于CON组、MAP组以及SO组则有显著地上升(P<0.05),SAP+Gd Cl3组TF值则相较于SAP组大鼠显著下降(P<0.05)。SO组和SO+Gd Cl3组两组大鼠体内,TF值相较于CON组大鼠无明显差异(P>0.05)。在不同的时间点上,采用流式细胞仪对大鼠TF-MPs指标进行检测,发现MAP组明显要高于CON组和SO组大鼠,三组间存在明显差异性(P<0.05),和MAP、CON两组大鼠相比,SAP组有显著地上升;但相较于MAP大鼠,MAP+Gd Cl3组大鼠TF-MPs水平显著下降,组间表现出显著性差异(P<0.05);和SAP组大鼠相比,SAP+Gd Cl3组大鼠的TF-MPs值同样也在下降,存在明显差异性(P<0.05)。WB分别检测6组KCs中6 h、12 h、24 h的TF和TLR4蛋白含量相比较,3个时间点表达趋势相同,TF、TLR4两项指标呈现出一致的趋势,存在明显差异性(P<0.05);通过组间比较:TF、TLR4两项指标上,MAP组大鼠的上升程度上明显高于SO组和CON组这两组大鼠(P<0.05);CON、CO以及MAP三组大鼠相比,SAP组大鼠的上述两项指标则上升更为显著(P<0.05);相比MAP组,MAP+Gd Cl3组大鼠的TF、TLR4这两项指标则有显著地下降(P<0.05),SAP+Gd Cl3组大鼠相较于SAP组明显降低(P<0.01)。Real-time PCR分别检测6组KCs中TF m RNA、TLR4 m RNA这两项指标的含量,6 h、12 h、24 h这几个时间点上,两者的表达趋势较为接近;TLR4 m RNA和TF m RNA在表达趋势上则完全相同,差异性较为显著(P<0.05);通过深入地对比:和SO、CON两组大鼠相比,MAP组大鼠的TF m RNA、TLR4 m RNA这两项指标的表达的上升程度更为明显(P<0.05);和CON、SO以及MAP三组大鼠相比,SAP组在上述两项指标的表达水平上则上升更为显著(P<0.05),MAP+Gd Cl3组较MAP组TF m RNA和TLR4 m RNA表达量明显减少(P<0.05),SAP+Gd Cl3组TF m RNA和TLR4 m RNA表达量较SAP组明显降低(P<0.01)。肝脏组织HE染色CON组为正常肝脏结构,SO组有轻微的肝细胞损害,无明显的炎症细胞浸润。MAP组大鼠体内的肝细胞轻-中度损伤,同时产生细胞质空泡,可见脂肪样变,炎症细胞浸润;和MAP组大鼠相比,MAP+Gd Cl3组大鼠的胰腺损伤较轻。SAP组大鼠肝细胞中至重度损伤,出现在散在的肝细胞坏死,细胞边界模糊,大量炎症细胞浸润;相较于SAP组大鼠,SAP+Gd Cl3组胰腺损伤程度相对要轻。根据胰腺病理切片观察结果:MAP组胰腺间质水肿,MAP+Gd Cl3组较MAP组病理损伤有所减轻;SAP组胰腺出现了凝固性坏死现象,同时可观察到大量炎症细胞浸润;和SAP组大鼠相比,SAP+Gd Cl3组大鼠的病理损伤程度相对要轻很多。免疫组化结果显示:SO组大鼠组织内部的TF表达呈现出弱阳性,MAP组表达则显著性上升;相较于SO组、MAP两组大鼠,SAP组大鼠的TF蛋白有显著地增加;MAP+Gd Cl3组比MAP组TF蛋白表达减弱,而SAP组大鼠TF蛋白表达则明显要比SAP+Gd Cl3组明显减弱。结论:AP状态下,KCs细胞中的TF、TLR4两项表达均明显上升,TF-MPs的释放量明显上升,使得大鼠凝血系统、纤溶系统功能均出现明显变化;通过对KCs进行抑制,有助于下调AP时TF的表达量;利用Gd Cl3对KCs予以阻断,则可阻断TLR4通路,使TF表达明显下调,平衡AP初期的微循环状态,对MAP转变为SAP起到抑制作用,并最终干扰AP的形成、演变。第三部分阻断TLR4信号通路对KCs表达TF及TF-MPs的调控目的:利用LPS模仿体内炎症刺激,探讨KCs在受到LPS刺激时能否释放出TF-MPs,判断阻断TLR4通路能否对KCs表达TF产生调控。方法:分为WT组和TLR4-/-组,WT组为野生型C57小鼠所分离培养的KCs,TLR4-/-组为TLR4-/-小鼠所分离培养的KCs,分别加LPS(300ng/ml)刺激,ELISA法检测各时间点的培养液上清TF浓度,流式细胞仪检测培养液上清的TF-MPs浓度。Western Blot法检测KCs中TF和TLR4的蛋白表达量;利用Real-time PCR法对KCs内部的TF m RNA、TLR4 m RNA这两项指标的表达水平进行检测。结果:在30min-120 min的时间点上,WT组小鼠的TF水平均较TLR4-/-组小鼠明显上升,存在明显差异性(P<0.05),WT组:从0 min到120 min,呈逐渐升高趋势;TLR4-/-组:0-60 min时段中,TF均在显著性上升;但在60 min、120 min这两个时段上无明显差异性(P>0.05)。在30min-120 min的时间点上,WT组小鼠的TF-MPs指标要比TLR4-/-组小鼠有显著地上升,差异有统计学意义(P<0.05),WT组:从0 min到60 min,呈逐渐升高趋势,但60 min和120 min无明显差别(P>0.05),TLR4-/-组:0-60 min这个时段中,TF-MPs水平逐渐升高;而60 min、120 min这两个时段,则不具有显著差异(P>0.05)。WT组TLR4蛋白表达量从0 min到30 min,呈逐渐上升状态;于30min抵达该表达的峰值;在60 min、120 min这两个时段上,TLR4指标未见明显差异性(P>0.05)。TLR4-/-组未检测到该指标的表达。在不同时间点上,WT组小鼠的TF蛋白表达要比TLR4-/-组小鼠显著上升,相比差异性较大(P<0.05);WT组:从0 min到30 min,该指标在持续上升,抵达峰值的时间为30 min,在60 min、120 min这两个时段上,其表达水平较为接近(P>0.05)。TLR4-/-组:0-30 min之间,该指标均在持续上升,抵达峰值的时间为30 min,在60 min、120 min这两个时段上,TF蛋白表达水平未见明显差异(P>0.05)。WT组比TLR4-/-组在30 min-120min时间点TF m RNA水平均在显著上升,存在较强的差异性(P<0.05);WT组:0-60 min时间点上,TF m RNA均在持续上升,抵达峰值的时间点为60 min;于120 min时开始下降。TLR4-/-组:0-60 min之间,TF m RNA表达持续上升,抵达峰值的时间点为60 min;120 min开始降低。0-60 min这一时间段,WT组小鼠的TLR4 m RNA表达不断上升,于60 min抵达高峰;从120 min开始缓慢降低。TLR4-/-组小鼠KCs内该指标无表达。结论:本研究证实敲除TLR4后TF及TF-MPs表达明显受到抑制,TLR4与TF及TF-MPs呈正相关,提示LPS或可利用TLR4这一路径,对KCs细胞内部的TF表达起到调节作用。通过TLR4受体,LPS或可对TLR4通路起到激活作用,促进KCs表达TF,通过TF-MPs而释放TF。