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食管癌（Esophageal carcinoma,EC）是世界范围内最常见的消化道肿瘤之一,发病率位居所有肿瘤第8位,尤其在中国高发,豫北地区尤其是林州地区发病率居世界第一。食管鳞癌是中国范围内最常见的食管癌组织学类型,占90%以上。因为有效的早期诊断方法缺乏,很多患者一旦发现即处于晚期,丧失了绝佳的治疗机会。尽管近年来以手术为主的治疗方法不断改进,但其死亡率居高不下,居所有肿瘤第6位,五年生存率约15%-34%,严重影响患者生活质量和身体健康。其发病机制考虑跟患者生活习惯、饮食结构、长期慢性刺激及基因有关,但仍不明确。因此,深入研究食管癌的发生发展机制,及其合适治疗方案是当前重要任务。肿瘤微环境是肿瘤发生、发展及转移时与周围环境相互作用形成的有利于肿瘤生长的环境,其具有低氧、高渗透性等特点,对人体免疫系统产生很大影响。肿瘤发生初期,T细胞还能被激活,但随着肿瘤的不断进展,抗原持续暴露,使T细胞功能及发生记忆T细胞分化程序发生明显改变,T细胞产生细胞因子的能力明显下降,细胞毒性、增殖能力及自我更新能力明显削弱,发生T细胞衰竭,甚至无法分化为记忆T细胞而发生细胞凋亡。T细胞衰竭发生后,会产生许多免疫检查点,如程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1,PD-1）,细胞毒性T细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4）,T细胞免疫球蛋白3（T cell immunoglobulin mucin 3,TIM-3）,淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte activation gene-3,LAG-3）,B和T淋巴细胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator,BTLA）,腺苷A2A受体（A2A adenosine receptor,A2AR）等,这些免疫检查点的高表达会与各自配体相互作用,分泌大量细胞因子,导致肿瘤进展。随着免疫治疗研究的不断深入,T细胞免疫治疗被认为现有阶段最重要和最有希望治疗肿瘤的方法,以PD-1和CTLA-4抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂给很多肿瘤患者带来了希望,但仍发现很多患者治疗无效或者效果不佳,了解治疗方法失败的原因是当前研究的关键。在本研究中,我们收集食管鳞癌患者手术切除的食管癌组织标本,选择了6种免疫检查点分子,通过免疫组织化学技术测定各个免疫检查点分子在食管鳞癌组织中的表达,并分析这些分子与各个临床病理参数的关系,以及对生存期的影响,并进行Western blot及q RT-PCR定量检测,探讨其中可能存在的机制,从而认识免疫检查点分子对食管鳞癌的影响。实验室分选患者血液和肿瘤中的T淋巴细胞,进行转录组测序,从转录水平进行对比二者的基因表达状况,以及肿瘤相关细胞因子,趋化因子,T淋巴细胞活化相关通路的差异性表达,进而对食管鳞癌患者浸润性淋巴细胞中高表达基因NFATC2进行检测,研究其与免疫检查点分子的相关性,并在C57BL/6小鼠中敲除Nfatc2,比较Nfatc2缺失小鼠与野生型小鼠之间PD-1、TIM-3及BTLA三个抑制分子的表达差异,为后续工作提供基础性及支撑性资源,也同时进一步揭示T淋巴细胞在肿瘤调控方面的作用。第一部分食管鳞癌组织中各免疫检查点分子的表达水平及临床意义研究方法经新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准,回顾性选取新乡医学院第一附属医院于2014年2月至2015年12月接受食管癌根治手术治疗的161例食管鳞癌患者石蜡标本,所有患者未进行术前治疗。使用免疫组织化学技术对所有标本中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、A2AR的表达进行测定,采用χ~2检验比较各免疫检查点分子与临床病理特征的关系,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,使用Log-rank法检验比较不同组生存曲线差异,采用Cox比例回归风险模型对数据进行单因素及多因素生存分析影响患者生存的因素,并对独立危险因素PD-1、TIM-3及BTLA进行Western blot及q RT-PCR定量检测。结果1.PD-1阳性表达与患者年龄及周围淋巴结有无转移密切相关,CTLA-4阳性表达与患者饮酒及周围淋巴结有无转移密切相关,TIM-3阳性表达与患者肿瘤浸润深度及周围淋巴结有无转移密切相关,LAG-3阳性表达与患者肿瘤病理分型,分化程度及周围淋巴结有无转移密切相关,BTLA阳性表达与饮酒,患者肿瘤分化程度,肿瘤浸润深度及周围淋巴结有无转移密切相关,A2AR阳性表达与患者年龄,肿瘤分化程度及周围淋巴结有无转移密切相关（P＜0.05）。2.单因素生存分析表明,分化程度、浸润深度、淋巴结转移、PD-1、CTLA-4、TIM-3、BTLA、A2AR为影响食管鳞癌患者总生存期的危险因素（P＜0.05）。多因素生存分析结果显示:肿瘤的分化程度（HR=0.294,95.0%CI:1.055-1.707,P=0.017）、淋巴结转移（HR=0.897,95.0%CI:1.654-3.637,P=0.001）、PD-1（HR=0.543,95.0%CI:1.075-2.757,P=0.024）、TIM-3（HR=0.788,95.0%CI:1.203-4.018,P=0.001）、BTLA（HR=0.563,95.0%CI:1.075-2.868,P=0.025）可做为影响食管鳞癌患者总生存的独立预后因素。3.Western blot及q RT-PCR定量检测显示,PD-1、TIM-3、BTLA在食管鳞癌中的表达显著高于癌旁组织。4.PD-1与TIM-3,PD-1与BTLA,TIM-3与BTLA的共表达显著降低了食管鳞癌患者的生存期（P＜0.05）。结论食管鳞癌患者中肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、PD-1、CTLA-4、TIM-3、BTLA、A2AR为影响总生存期的危险因素,而肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及PD-1、TIM-3、BTLA是影响食管鳞癌患者总生存的独立预后因素。PD-1与TIM-3,PD-1与BTLA,TIM-3与BTLA的共表达显著降低了食管鳞癌患者的生存期,为联合靶向免疫检查点分子药物提供了理论基础。第二部分食管鳞癌患者外周血和肿瘤浸润性淋巴细胞表达特征研究方法经新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准,选取7名手术患者,抽取术前2h外周静脉血,密度梯度离心法收集外周血中的淋巴细胞层,并分离提取新鲜食管鳞癌组织中的肿瘤浸润性淋巴细胞,将两者淋巴细胞表面蛋白进行流式染色,记录的数据通过FLOWJO 10.0.版本进行分析。磁珠分选外周血和肿瘤中CD3阳性细胞,对14个样本进行微量细胞的RNA提取并进行测序,从而比较外周血和肿瘤浸润淋巴细胞转录组水平,将筛选到的差异性表达基因富集在具体的信号通路,从而分析肿瘤微环境和T淋巴细胞相互调节的具体通路参与情况。对高表达基因NFATC2进行免疫组化检测,分析其与PD-1、TIM-3、BTLA的关系,进行流式染色测定肿瘤浸润性淋巴细胞和外周血淋巴细胞中NFATC2磷酸化的表达,并在C57BL/6小鼠中敲除Nfatc2,刺激T细胞使之诱导抑制分子的表达,比较Nfatc2缺失小鼠与野生型小鼠之间PD-1、TIM-3及BTLA的表达差异。结果1.患者的外周血与肿瘤组织进行对比,都存在大量的差异性表达基因,每组差异性表达基因的数量范围为8048-12819,平均差异性表达基因数量为11477。2.患者同一组织的相关性较好,但是肿瘤与外周血对比相关性相对较弱,具有明显的差异性。3.NFATC2与PD-1、TIM-3与BTLA在食管鳞癌中的表达呈显著正相关（P＜0.05）。4.肿瘤组织CD4和CD8 T细胞中NFATC2的磷酸化水平中均显著高于外周血,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.PD-1、TIM-3与BTLA在Nfatc2缺失小鼠中的表达显著下降,具有统计学意义（P＜0.001）。结论本研究基于相同食管鳞癌患者外周血T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞在全基因组水平的RNA测序分析,发现了肿瘤组织中T细胞基因表达与外周血T细胞存在巨大差异,全基因组RNA测序结果证明了肿瘤微环境对T细胞存在强效的调控作用。并发现肿瘤浸润淋巴细胞中高表达基因NFATC2与PD-1、TIM-3与BTLA表达显著正相关,敲除Nfatc2可以明显降低PD-1、TIM-3及BTLA的表达,表明NFATC2为调控T细胞抑制受体的重要转录因子。