味觉是每个人日常生活的重要组成部分,而甜味尤其重要,他可以预示营养物质的存在,增强食物的味道和可口性,影响摄入食物的选择。碳水化合物类甜味剂因为其自身的愉悦味道及高能量而备受人们的青睐,但过度摄入会引起肥胖及肥胖相关的疾病,所以低热量或无热量的甜味剂的开发对于食品领域的发展至关重要。为了满足日益增长的对这些甜味剂的需求,大批科学家正在从各个方面寻找方法诠释甜味感受的机制,以便指导新型甜味剂的开发。而细胞水平上的甜味机理研究主要以钙影像,电生理为手段,而本实验室利用近年来发展起来的等温量热滴定技术手段,对细胞水平上甜味感受的热动力学进行研究,以期从新的角度诠释甜味识别机理。前期的研究建立了一套有效分离纯化味蕾细胞的方法,寻找了一种在生物学和功能学基础上与味蕾细胞类似的细胞株系NCI-H716作为味蕾细胞的替代细胞;确定了用于细胞甜味识别热力学研究的等温量热滴定各种实验条件;系统的研究了不同浓度的同种甜味剂、同种浓度不同甜味剂与味蕾细胞相互作用的热力学行为;证明了ITC作为一种新型实验手段在活细胞层面上通过热力学参量研究受体与配体分子相互作用的物理化学机制的可行性,在甜味识别的热动力学机制方面做了开创性工作。但以上两种细胞作为滴定对象均无法有效的获取稳定的甜味识别热力学数据,可能原因是由于无论从小鼠舌面直接分离的味觉细胞,还是甜味受体的味觉细胞的替代细胞NCI-H716分别存在细胞稳定性及纯度问题和细胞蛋白成分复杂的问题。所以如何建立一种细胞来源的稳定,并且细胞蛋白成分单一的细胞就成为本实验顺利进行的总要前提。所以本研究利用广泛应用于细胞水平上甜味机理研究的甜味受体蛋白异源表达技术,构建了能够稳定高效表达甜味受体蛋白T1R2/T1R3及下游信号转导分子Ga15蛋白的细胞株,为上述实验的顺利进行提供细胞来源,同时为许多细胞实验提供方法学基础。实验结果如下:　　 (1)Gαl5、T1R2和T1R3基因的获取与真核表达载体的构建。以C57BL/6J小鼠为实验对象,针对NCBI上公布的Ga15(NM_010304-3)、T1R2(NM_031873.1)和T1R3(NM_031872.2)参考序列,利用Primer5.0设计引物,成功获得了编码Gα15、T1R2和T1R3的基因。后将三组基因分别与pEGFP-C1,pDsRed1-N1,pcDNATM6.2质粒重组构建了用于真核的表达载体。酶切结果表明目的基因已经准确插入质粒,PCR及测序结果表明编码三种蛋白基因序列正确。　　 (2)稳定表达Gα15/T1R2/T1R3蛋白细胞株的构建与筛选。鉴于稳定细胞的构建需要相应抗生素的筛选,所以在重组载体转化之前首先以HEK293细胞为实验对象,确定该细胞株对筛选抗生素的敏感度,最终确定用于稳定细胞筛选所用的G418与灭稻瘟菌素(Blasticidin)浓度分别为5μg/ml和4μg/ml。　　 由于三种基因同时转染细胞的技术比较困难,所以本实验首先将Gα15基因转入HEK293细胞建立稳定表达Gα15基因的HEK293细胞株,而后再将T1R2/T1R3基因转入HEK293-Gα15细胞。以建立的HEK293-Gα15细胞株为对象,再将T1R2/T1R3导入。利用重组载体构建时的表达标签(GFP、RFP和YFP),初步表明重组载体成功导入宿主细胞,并且初步构建了稳定表达甜味受体蛋白及下游信号转导蛋白的细胞株HEK293-Gα15/T1R2/T1R3。　　 (3)Gα15/T1R2/T1R3蛋白的鉴定。通过PCR及western blotting技术对获得稳定表达Gα15/T1R2/T1R3蛋白的细胞株进行进一步确定。PCR及Western结果均表明稳定表达Gα15/T1R2/T1R3被成功构建。