【摘 要】
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研究目的:肿瘤细胞的耐药性是肿瘤治疗过程中遇到的一个难题。研究表明BCL-2家族在肿瘤细胞的存活和耐药性中扮演着重要角色。BCL-2家族根据其功能可以分为抗凋亡亚家族和促凋亡亚家族。MCL1属于BCL-2家族中的抗凋亡亚家族,其最早是在髓系白血病细胞诱导分化成单核巨噬细胞时发现的。研究表明MCL1在胚胎发育、淋巴系统发育、细胞生长、细胞存活中扮演着关键角色。一些肿瘤通过高表达MCL1基因达到抗凋亡
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81571250）; 福建省自然科学基金项目（2018J01838）
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研究目的:肿瘤细胞的耐药性是肿瘤治疗过程中遇到的一个难题。研究表明BCL-2家族在肿瘤细胞的存活和耐药性中扮演着重要角色。BCL-2家族根据其功能可以分为抗凋亡亚家族和促凋亡亚家族。MCL1属于BCL-2家族中的抗凋亡亚家族,其最早是在髓系白血病细胞诱导分化成单核巨噬细胞时发现的。研究表明MCL1在胚胎发育、淋巴系统发育、细胞生长、细胞存活中扮演着关键角色。一些肿瘤通过高表达MCL1基因达到抗凋亡和耐药的效果。通过干预MCL1基因能够大大增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。因此MCL1的功能研究及其靶向药物研究备受关注。MCL1基因的功能受到转录水平和翻译后修饰等方面调控。其中泛素化修饰被证明在调控MCL1蛋白功能中扮演着重要角色。研究表明MCL1蛋白会与多种泛素连接酶发生相互作用而被泛素化,使其被蛋白酶体所降解。目前关于MCL1蛋白的去泛素化酶研究较少,因此调控MCL1的去泛素化酶依然有待研究。本课题旨在通过利用去泛素化酶基因表达库寻找调控MCL1的去泛素化酶,研究去泛素化酶调控MCL1的具体机制以及在肿瘤耐药性中的作用。研究方法:1.将去泛素化酶基因表达库质粒与对照质粒分别转染至He La细胞中,36小时后收取细胞样品,利用Western Blot技术进行检测和筛选能够上调MCL1蛋白水平的去泛素化酶;2.构建筛选到的去泛素化酶的基因敲低克隆,通过慢病毒感染细胞来敲低去泛素化酶,利用Western Blot技术检测敲低效果以及对MCL1蛋白水平的影响;3.将筛选到的去泛素化酶与MCL1质粒共转染至细胞中,加入蛋白合成抑制剂Cycloheximide处理一定的时间,利用Western Blot技术检测MCL1的蛋白水平;4.构建筛选到的去泛素化酶的酶活突变体以及结构域缺失体表达克隆,并将这些表达克隆分别转染至细胞中,利用Western Blot技术检测MCL1的蛋白水平;5.将筛选到的去泛素化酶与MCL1质粒共转染至293T细胞中,利用免疫共沉淀技术检测去泛素化酶是否与MCL1存在相互作用;6.将对照载体,筛选到的去泛素化酶表达载体及其相应的酶活突变表达载体,分别与MCL1和泛素表达载体共转染至细胞中,利用免疫共沉淀技术检测去泛素化酶对MCL1泛素化水平的影响;7.在敲低或过表达去泛素化酶的稳定细胞系及其对照细胞中,加入BH3mimetic抑制剂ABT-263或ABT-263和Sorafenib,利用Cell Titer-Glo试剂盒检测细胞的存活率;8.利用生物信息学方法分析筛选到的去泛素化酶基因表达量与肿瘤患者生存率的关系。研究结果:1.通过筛选和鉴定,我们发现了在多种细胞系中去泛素化酶OTUD1均能明显上调MCL1蛋白水平;2.敲低OTUD1能下调MCL1的蛋白水平;3.过表达OTUD1能提高MCL1蛋白的稳定性;4.过表达野生型的OTUD1以及OTUD1的酶活结构域能明显上调MCL1的蛋白水平,而OTUD1的酶活突变体及其N端结构域则不影响MCL1的蛋白水平;5.免疫共沉淀实验结果表明OTUD1及其酶活结构域均能够与MCL1发生相互作用;6.免疫共沉淀实验结果表明OTUD1能够去泛素化MCL1,而OTUD1的酶活突变体丧失此功能;7.过表达OTUD1能抑制ABT-263对肿瘤细胞的杀伤效果,反之,敲低OTUD1能促进ABT-263对肿瘤细胞的杀伤效果;同时过表达OTUD1能抑制ABT-263和Sorafenib对肿瘤细胞的杀伤效果;8.在肝癌,卵巢癌,以及乳腺癌和宫颈癌的部分亚型患者中,OTUD1的高表达是不良预后的指标。结论:OTUD1可与MCL1发生相互作用,并介导MCL1的去泛素化,从而影响MCL1蛋白的稳定性。细胞功能研究表明OTUD1影响ABT-263及其与Sorafenib联合用药对肿瘤细胞的杀伤效果。生物信息学分析表明OTUD1的高表达与多种肿瘤患者的预后负相关。
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