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急性呼吸窘迫综合征（acute respiratry distress syndrome,ARDS）是一种临床常见的危重症,其特征是急性炎症和肺泡-毛细血管屏障被破坏,导致进行性呼吸困难、低氧血症和呼吸衰竭。尽管保护性通气策略、俯卧位通气、体外膜肺氧合等支持性治疗取得重大进展,但仍有部分ARDS患者因肺组织持续性损伤和异常修复出现病理性细胞外基质（extracellular matrix,ECM）重塑,最终发展成为肺纤维化,导致患者预后不良或出院后健康相关生活质量下降。因此,研究ECM重塑的调控机制和探寻潜在的治疗靶点,是防治ARDS肺纤维化发展的关键。Nur77是一种广泛存在于各组织和细胞中的转录因子,受炎症因子、生长因子和激素等信号刺激快速表达和激活,并通过转录调控靶基因表达,与不同蛋白相互作用等方式参与生物学过程。目前研究发现Nur77及其下游产物在ARDS中有降低炎症反应、减轻肺损伤的作用。此外,在其他疾病中Nur77展现出抗纤维化作用。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一种多效性细胞因子,在调节肺发育、损伤修复和纤维化中起重要作用。伴随着ARDS早期组织损伤,TGF-β1被激活。活化的TGF-β1与受体结合通过Smad信号通路诱导胶原蛋白产生。本课题组前期研究发现TGF-β1通过上调MMP9表达参与ARDS肺组织ECM重塑。既往研究发现,Nur77参与调节TGF-β1信号传导,但作用结果是截然相反的。目前,Nur77在ARDS肺组织ECM重塑的作用尚不清楚,对TGF-β/Smad信号通路的调控机制也有待深入探讨。本研究通过建立LPS诱导的ARDS大鼠模型和体外培养A549细胞开展实验,探讨Nur77对ARDS肺组织ECM重塑的作用及调控机制,为防治ARDS肺纤维化发展提供新的思路和干预靶点。本文的研究内容包括:1.通过尾静脉注射LPS建立ARDS大鼠模型,并给与Nur77激动剂Cytosporone B（Csn B）处理。将32只SD大鼠随机分配至Control组、LPS组、Csn B组、LPS+Csn B组。检测肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性、支气管肺泡灌洗液中细胞总数、HE染色分析大鼠肺组织炎症损伤程度;检测羟脯氨酸含量、Masson染色评价胶原纤维沉积情况;利用q PCR、Western Blot、免疫组织化学法检测MMP9、TIMP1表达变化。2.利用慢病毒转染构建稳定敲除和过表达Nur77的A549细胞株。应用q PCR和Western Blot方法验证敲除和过表达效果。使用PBS和LPS处理野生型、敲除Nur77、过表达Nur77的A549细胞24小时,应用Western Blot方法验证Nur77对MMP9的调控作用。3.应用双荧光素酶报告实验分析过表达Nur77对TGF-β/Smad信号通路转录活性的影响。使用PBS和TGF-β处理野生型、敲除Nur77的A549细胞,应用Western Blot方法检测不同时间梯度MMP9、P-Smad3、Smad3蛋白表达水平;应用免疫荧光技术分析Nur77是否能影响Smad3亚细胞定位。免疫共沉淀技术检测Nur77与Smad3的相互作用情况。4.使用JASPAR数据库预测Nur77与MMP9启动子区结合的位点,应用染色质免疫共沉淀实验检测Nur77是否与MMP9启动子区结合;构建含MMP9启动子区结合位点以及突变体的质粒,应用双荧光素酶报告实验验证Nur77是否与MMP9启动子区直接结合,以及Nur77对MMP9转录活性的调节作用。结果表明:1.结果显示LPS组MPO活性增加,肺组织结构破坏严重,可见大量红细胞和炎症细胞浸润,肺泡间隔增厚,胶原纤维过度沉积;使用Nur77激动剂Csn B预处理能减少肺炎症反应、组织病理损伤和胶原纤维沉积。LPS+Csn B组的MMP9蛋白和m RNA表达水平低于LPS组,TIMP1表达不受Csn B预处理影响。2.qPCR和Western Blot结果显示稳定敲除和过表达Nur77的A549细胞株构建成功。与野生型A549细胞相比,过表达Nur77能抑制LPS诱导的MMP9蛋白表达;相反,敲除Nur77能显著增加LPS诱导的MMP9蛋白表达。3.双荧光素酶报告实验结果显示,过表达Nur77抑制A549细胞中TGF-β/Smad信号通路转录活性。敲除Nur77使TGF-β1诱导的MMP9、P-Smad3表达升高;过表达Nur77抑制Smad3从细胞质转移到细胞核。免疫共沉淀结果显示Nur77与Smad3之间存在相互作用。4.JASPAR数据库预测在MMP9转录起始点上游-999bp～-990bp位置,存在与Nur77结合的位点。染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验结果确认Nur77与该位点直接结合,并抑制MMP9转录活性。结论:1.Nur77缓解LPS诱导的ARDS大鼠肺组织炎症程度,减少胶原纤维过度沉积,在ARDS炎症反应和ECM重塑中起保护作用。2.Nur77与MMP9转录起始点上游-999bp～-990bp位置直接结合,通过负调控MMP9表达参与ECM重塑。3.Nur77通过与Smad3结合,抑制Smad3磷酸化和核转移,从而阻断A549细胞中TGF-β1/Smad3/MMP9信号传导。