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大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在西方国家占肿瘤相关死因的第三位。近年来大肠癌发病率和死亡率在我国均呈上升趋势,但大肠癌的发病机制有待阐明。已有研究表明大肠癌中存在大肠肿瘤干细胞,它可能是大肠癌发生发展的根源。我们先前的研究中发现了一个新的分子—Nrip2,它在CD133+大肠癌细胞中出现了显著“沉默”,重新表达Nrip2显著抑制CD133+大肠癌细胞在NOD/SCID鼠的成瘤性,提示沉默Nrip2是促进大肠癌干细胞致瘤性新的分子机制。Nrip2可能是靶向抑制大肠癌干细胞治疗的一个新的潜在靶点。然而目前对Nrip2作用分子机制尚不明了。实验目的：本研究拟在先前研究基础上,研究Nrip2分子功能及参与调控Nrip2的细胞信息通路,鉴定Nrip2相互作用蛋白,为今后研制新的针对肿瘤干细胞低毒性分子靶向药物打下基础。实验方法：1.细胞定位：构建Brip2-pEGFP-C1重组质粒,转染到细胞后在共聚焦显微镜下观察Nrip2在细胞中的定位。2.磷酸化位点与定点突变：利用生物信息学预测Nrip2磷酸化位点,建立高表达Nrip2的稳定细胞系,用Western blot验证磷酸化位点,并进行定点突变改变磷酸化位点的氨基酸,观察突变体Nrip2在细胞中的定位有无改变。3.检测Wnt通路：为了研究Nrip2及其突变体与Wnt信号的关系,用双荧光报告基因方法检测野生型和突变体Nrip2对β-Catenin活性的影响。4.成瘤实验：通过高表达Nrip2后观察Nrip2对动物成瘤实验的影响。5.免疫共沉淀：将Nrip2-pEGFP-C1重组质粒瞬时转染293T细胞,通过免疫共沉淀的方法将与Nrip2相互作用的蛋白沉淀下来,再通过SDS-PAGE染色后串联质谱预测蛋白及随机抗体筛选法鉴定出与Nrip2相互作用蛋白。实验结果：1.Nrip2主要分布于细胞质、细胞核,部分分布于溶酶体。2.Nrip2的S34和T152分别能被Akt和PKA激酶磷酸化,提示Nrip2功能可能受Akt和PKA激酶调节,改变磷酸化位点的氨基酸S34A及T152A对细胞定位无明显影响。3.野生型Nrip2和S34A突变体可不同程度的抑制β-Catenin活性,而T152A突变体对β-Catenin活性无明显影响。4.高表达Nrip2能抑制SW620细胞的致瘤性。5.筛选出HSP73,PKM2,FZD1为Nrip2相互作用蛋白。结论：1.野生型Nrip2和S34A及T152A突变体均主要分布于细胞质、细胞核,部分分布于溶酶体。2.Nrip2的S34和T152分别能被Akt和PKA激酶磷酸化。3.Nrip2具有肿瘤抑制基因的功能。4.HSP73、PKM2、FZD1为Nrip2的靶蛋白。5.Nrip2可能通过Wnt通路对大肠癌的发生发展进行调控。