一、研究背景肝癌是严重威胁人类健康的一大疾患,中西医结合治疗贯穿我国肝癌防治的全过程中,中医药在肝癌预防、治疗以及防止复发转移等方面有着独特的优势。研究发现某些天然中药及其提取物通过对肿瘤发生发展过程中某一环节及其相关因子发挥作用达到多层次、多靶点抗肿瘤效果,中药防治肿瘤的作用主要围绕防治癌前病变,抑制癌灶生长包括直接杀灭肿瘤、抑制增殖、诱导分化、促进凋亡,抑制肝癌转移包括抑制细胞转移相关运动,抑制转移相关基因、粘附分子、膜相关分子、血管生成相关因子等的表达,增强机体免疫等。抑制肿瘤生长和转移的是中药发挥抗癌作用的重要作用途径。猫人参为江浙地区临床常用抗肿瘤药,广泛运用于肝癌、转移性肺癌、乳腺癌等的临床治疗。浙江大学对猫人参有效成分研究发现该植物中富含人体所需的各种无机元素,根茎部位含有丰富的氨基酸,特别是一些具有特殊生理活性的氨基酸含量较高,猫人参乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分得24-三羟基-12烯-齐墩果烷,积雪草酸,儿茶素,isotachioside,表儿茶素,熊果酸,胡萝卜苷,β-谷甾醇等有效成分。既往研究表明单味猫人参注射液对肝癌、白血病及结肠癌细胞株有一定的抑制作用,从猫人参中提取分离的葸醌类和皂苷类的复合物均被证实有抗肿瘤活性,能够抑制小鼠皮下移植瘤的生长。本课题在对猫人参进行有效成分提取和初筛的基础上,进一步观察猫人参总皂苷对肝癌体内体外生长转移的作用。二、研究目的1体外观察猫人参总皂苷对人肝癌细胞株的增殖抑制作用,观察其对部分肝癌细胞划痕、粘附、侵袭、趋化实验的作用效果,了解猫人参总皂苷对肝癌体外增殖和转移的作用。2观察猫人参总皂苷对小鼠肝癌皮下移植瘤模型和转移瘤模型的作用,了解猫人参总皂苷对肝癌体内生长和转移的效果。三、研究方法第一部分猫人参总皂苷对肝癌细胞体外实验作用观察1通过四氮唑盐还原法(MTT法)检测不同浓度猫人参总皂苷对不同人肝癌细胞株BEL-7402、MHCC-97-H、HepG2、SMMC-7721、PLC的增殖影响,从中选出抑制作用最强和(或)具有高转移能力的肝癌细胞进行转移运动相关实验。初步确定猫人参总皂苷发挥增殖抑制效果的浓度范围,筛选出无明显增殖抑制作用的药物浓度范围进行下一步实验。2进行体外划痕实验,观察猫人参总皂苷对肝癌细胞迁移运动的作用。3观察猫人参总皂苷对肝癌细胞粘附实验的作用,计算其粘附抑制率。4采用Transwell小室模拟侵袭运动环境,进行侵袭实验,观察猫人参总皂苷对肝癌细胞侵袭运动的抑制作用,计算侵袭抑制率。5通过趋化运动实验观察猫人参总皂苷对肝癌细胞趋化运动的效果,计算趋化抑制率。第二部分猫人参总皂苷抗肝癌生长转移体内实验研究1猫人参总皂苷对肝癌体内生长的作用接种肝癌细胞于小鼠左前肢腋部皮下,待皮下瘤形成以后将小鼠随机分组,分别给与100 mg/kg/d、50 mg/kg/d及等浓度的溶剂作为对照组,腹腔注射给药一日一次,连续给药10 d,期间观察不同组别老鼠的活动情况、瘤体大小、体重、饮食饮水量等状况。停药24 h后颈椎脱臼处死小鼠,剥取瘤块称重,观察肺、心、肝、肺、肾、脾脏、胸腺等器官,留取部分进行组织病理学检查。对肿瘤组织行免疫组化染色,运用IMS医学图象定量分析软件检测肿瘤组织MVD、VEGF、bFGF的表达情况。2猫人参总皂苷对肝癌体内转移的作用通过尾静脉注射小鼠肝癌细胞构建小鼠肝癌肺转移瘤模型,隔日给药,剂量及方法同前,连续给药14天。观察用药后动物的一般情况:包括活动情况,体重毛色,饮食饮水量,有无消瘦及死亡等。停药24小时后称小鼠体重,眼眶取血,送检血常规,脱臼处死小鼠,剥取脾脏、胸腺称重,剥取小鼠肺组织,Bouin液染色24小时后,75%酒精固定,观察肺转移癌灶数。包埋肺组织,制成蜡块,HE染色,镜下观察不同组肺内组织及瘤灶的情况。四、研究结果第一部分猫人参总皂苷对肝癌细胞体外实验作用观察1 MTT结果猫人参总皂苷对BEL-7402细胞增殖抑制作用最强,呈高度敏感,抑制效果呈浓度依赖性,1.50 mg/ml猫人参总皂苷24、48、72小时时间点抑制率分别为(68.38±10.33)、(61.13±18.37)、(82.96±2.24)%,半数抑制浓度分别为(1.16±0.02)、(1.39±0.67)、(0.92±0.42)mg/ml。猫人参总皂苷浓度低于0.50 mg/ml时,对细胞增殖无明显抑制作用。1.50 mg/ml猫人参总皂苷对MHCC-97-H细胞增殖抑制率为36%。2划痕实验分别对BEL-7402和MHCC-97-H肝癌细胞进行24小时划痕实验,结果显示猫人参总皂苷对其迁移均有一定的抑制作用,镜下细胞迁移的程度为400＜200＜100μg/ml＜空白对照组,猫人参皂苷对肝癌细胞迁移能力的抑制效果随着药物的浓度增加而增强。3猫人参总皂苷对肝癌细胞粘附的抑制作用200μg/ml浓度下猫人参总皂苷对肝癌BEL-7402、MHCC-97-H细胞粘附作用的抑制率分别为(49.85±5.25)、(48.50±4.86)%,浓度低于200μg/ml时,抑制率随着药物浓度下降而递减。4猫人参总皂苷对肝癌细胞侵袭的抑制作用选择200、100、50μg/ml的猫人参皂苷进行侵袭实验,发现200μg/ml浓度下MHCC-97-H的侵袭抑制率为(69.78±4.88)%,对BEL-7402细胞的侵袭抑制率为(82.48±0.25)%,抑制效果呈现浓度依赖性。5猫人参总皂苷对肝癌细胞趋化的抑制作用趋化实验结果显示200μg/ml浓度下的猫人参总皂苷对MHCC-97-H的趋化抑制率为(49.13±2.91)%,对BEL-7402细胞的趋化抑制率为(79.37±0.09)%,抑制效果呈现浓度依赖性。第二部分猫人参总皂苷抗肝癌生长转移体内实验研究1猫人参总皂苷抑制肝癌体内生长的作用高、低剂量的猫人参总皂苷组的瘤重明显低于空白对照组,差异有显著意义(P＜0.05)。给药组MVD、VEGF、bFGF阳性表达率均低于空白对照组。2猫人参总皂苷抑制肝癌体内转移的作用高、低剂量的猫人参总皂苷组转移瘤结节数明显低于空白对照组,差异有显著意义(P＜0.05)。五、研究结论1猫人参总皂苷能够抑制肝癌细胞的增殖,对BEL-7402细胞增殖抑制作用最强。猫人参总皂苷能够抑制肝癌细胞的迁移、粘附、侵袭、趋化等转移相关运动能力。2猫人参总皂苷能够抑制小鼠原发性和转移性肝癌的生长,抑制肝癌的体内生长和转移,降低瘤内MVD、VEGF、bFGF的表达,促进瘤灶坏死可能是其抗肿瘤机制之一。