【摘 要】
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草莓（Fragaria×ananassa Duch.）属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,具有较高的经济价值和营养价值。草莓开花的早晚直接关系到草莓的生产环节,间接影响了草莓的经济收益。开花是一个极其复杂的过程,需要多个基因交叉调控,才能精准控制开花时间。本研究通过构建MIR160、ARF18过表达载体和ARF18敲除载体,得到草莓转基因植株,通过观察草莓转基因植株的表型,揭示出草莓mi R160-A
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草莓（Fragaria×ananassa Duch.）属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,具有较高的经济价值和营养价值。草莓开花的早晚直接关系到草莓的生产环节,间接影响了草莓的经济收益。开花是一个极其复杂的过程,需要多个基因交叉调控,才能精准控制开花时间。本研究通过构建MIR160、ARF18过表达载体和ARF18敲除载体,得到草莓转基因植株,通过观察草莓转基因植株的表型,揭示出草莓mi R160-ARF18模块在草莓开花中的功能,主要研究内容如下:1.根据sRNAanno数据库信息,从二倍体森林草莓中找到两个Fvemi R160家族成员:Fvemi R160a和Fvemi R160b,且Fvemi R160a和Fvemi R160b的成熟序列一致。利用二倍体森林草莓‘Ruegen’DNA,克隆得到Fvemi R160a的基因前体序列,即Fve MIR160a,将其进行核苷酸序列比对发现,克隆获得的序列与GDR数据库序列相似度为99.4%。通过对mi R160成熟序列的系统发育和多重序列比对分析,结果表明mi R160家族成员的成熟序列具有较高的保守性。2.构建了Fve MIR160的过表达载体,通过农杆菌介导的草莓遗传转化方式,将其转入到‘Ruegen’草莓叶片中,获得3个过表达Fve MIR160基因的草莓转基因株系。通过观察对照植株和转基因植株之间的表型差异,发现过表达Fve MIR160基因的转基因植株的开花时间比对照植株早。营养生长天数统计结果表明,对照植株的营养生长时间大约为86 d,转基因植株的营养生长时间大约为72 d,对照植株的营养生长天数比过表达Fve MIR160转基因植株的营养生长天数晚14 d;对照植株的果实成熟天数大约为178d,过表达Fve MIR160转基因植株的果实成熟天数大约为166 d,与对照相比提早12 d,表明过表达Fvemi R160可以促进草莓开花。对其叶片数目调查后,发现过表达MIR160转基因植株的叶片数目高于对照植株,是对照植株的1.5倍。3.从二倍体森林草莓‘Ruegen’叶片中克隆了Fve ARF18基因,发现其编码区序列长度为2136 bp,编码711个氨基酸,进化树分析发现其与蔷薇科中月季的同源性最高,且在N端包含保守的DNA结合结构域B3和Auxin＿resp域。亚细胞定位和转录活性分析试验表明,Fve ARF18是不具有转录激活活性的核蛋白。4.通过5’RLM-RACE试验分析,证明了草莓中mi R160-ARF18模块的存在,mi R160的切割位点位于ARF18基因编码区的第1351到1352个核苷酸之间。q RT-PCR分析表明过表达Fve MIR160的草莓转基因植株中Fve ARF18基因的表达量显著减少,表明mi R160可以负调控ARF18的表达,ARF18是mi R160的靶基因。5.利用不同激素分别处理‘Ruegen’草莓试管苗后,发现GA、IAA、ABA、SA和JA可以促进Fve ARF18基因的表达。采用不同浓度和时间梯度IAA分别处理时,Fve ARF18基因的表达量在10μmol·L-1IAA处理24 h时最高。6.分别构建了Fve ARF18的过表达载体和敲除载体,通过农杆菌介导的草莓遗传转化方法,将其转入到‘Ruegen’草莓叶片中,获得3个过表达Fve ARF18基因的草莓转基因株系。对草莓ARF18基因进行生物学功能分析后,发现过表达Fve ARF18基因的转基因植株的开花时间比对照植株晚。营养生长天数统计结果表明,对照植株的营养生长时间大约为60 d,转基因植株的营养生长时间大约为67 d,对照植株的营养生长天数比过表达Fve ARF18转基因植株的营养生长天数早7 d。同时,对照植株叶片数目多于过表达ARF18转基因植株,是过表达ARF18转基因植株的1.4倍。本研究明确了mi R160-ARF18模块调控草莓开花的生物学功能,为进一步利用生物技术手段,缩短草莓育种年限,培育早花品种具有重要的实践意义。
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