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主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是介导机体免疫反应,移植排斥反应和免疫调控的一组联系密切,呈高度多态的基因群。在生物体防御病原微生物入侵和保持自身结构过程中发挥着关键作用。MHC基因编码产生的分子包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类分子。MHC Ⅰ分子是由一条重链(α)和轻链(β2微球蛋白)结合构成,广泛分布于机体各个部分,在所有的有核细胞表面均有表达。MHC Ⅰ类分子在机体免疫应答反应中扮演着桥梁的作用,具有识别内源性抗原肽并与之结合的功能,然后将与其一起递呈给CD8~+T细胞。MHC Ⅱ类分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,也是由重链和轻链通过二硫键构成异源二聚体。MHC Ⅱ类分子的分布则比较局限,仅在抗原递呈细胞表达,精子和内皮细胞也有少量表达。MHC Ⅱ类分子将外源性抗原肽通过恒定链的参与转运到细胞的表面,最终被CD4~+T细胞发现,从而诱导细胞免疫的产生。恒定链(invariant chain,Ii)为MHC Ⅱ分子的辅助性蛋白,在MHC Ⅱ类分子的三聚体形成,九聚体组装和参与机体呈递外源性抗原肽过程中发挥着重要作用。因为其没有多态性,因此命名为恒定链。研究发现恒定链在MHC分子参与免疫应答过程中起着重要作用,然而在过去的研究中仅仅报道Ii可以与MHC分子相互作用,但是进一步的探索,Ii具体与MHC哪部分功能域相互作用却并不清楚,因此,本实验将MHCⅠ类和MHC Ⅱ类划分不同功能域,通过原核表达系统和真核表达系统来进一步研究他们之间的相互作用。首先,根据GenBank查询得到草鱼(Ctid)MhcⅠα(登录号:AB540144)、MhcⅡβ(登录号:JF436931)和恒定链(Ii)(登录号:KM369885)的基因序列,通过序列设计出引物,通过提取草鱼cDNA克隆出各个功能域的Mhc基因。将克隆得到的序列插入到原核表达载体pET-32a和pEGXT-4T-1,得到相应的重组质粒。然后将质粒导入进表达型大肠杆菌上得到相应的重组菌,将重组菌诱导表达后收集菌体,经过反复冻融并超声裂解得到相应的蛋白,带有GST标签的蛋白用GST琼脂糖凝胶柱纯化,带有His标签的蛋白用镍离子层析柱纯化,将纯化后的蛋白混合孵育经镍离子层析柱Pull-down技术检测蛋白间结合情况,并通过SDS-PAGE凝胶电泳观察相互作用结果同时用免疫印迹验证目的蛋白。将克隆出基因插入到真核表达载体pEGFP-N1和pmCherry-N1上,得到相应的真核重组质粒,将相应的质粒共转染到293T细胞上,利用激光共聚焦显微镜来观测他们在真核细胞中的定位及与Ii的相互作用情况。同时通过与细胞器的共定位,探究MHC分子和Ii在抗原递呈过程中的转运途径。实验结果表明:在细胞体外结合实验中,MHC分子的肽结合区具有结合Ii的功能,而且不受自身信号肽影响,而没有肽结合区的功能域则不具此功能。在真核细胞实验中,拥有肽结合区的MHC分子同样可以与Ii发生结合。同时,拥有肽结合区的Mhc基因和Ii基因表达产物定位于细胞内膜和外膜上,而没有肽结合区的功能域则丧失了定位的功能,出现于整个细胞。MHC分子在多种细胞器(高尔基体,内质网,内吞体)以及细胞膜上均有表达,验证了其递呈抗原的过程。