1.背景　　幼年特发性关节炎是儿童时期常见的慢性结缔组织疾病以慢性关节滑膜炎为主要特征,可伴有全身多器官功能损害是造成小儿致残和失明的重要原因。JIA的起病多较隐匿，目前诊断主要依靠临床和影像学表现，缺乏特异和敏感的生物指标物，同时JIA发病机制仍不清楚，从而为生物靶向治疗带来困难。　　JIA的发病主要由于细胞免疫功能紊乱，目前认为与IL-6/JAK/STAT通路异常激活息息相关。白介素6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的细胞因子。能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；和集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，调理免疫，增强自然杀伤细胞的裂解功能。作为一个炎症因子，能调控内环境功能，包括糖代谢和下丘脑垂体肾上腺素轴的调节。可以引起发热，诱导急性期蛋白和提高外周血白细胞计数。Tocilizumab[2]是一种重组人源化抗人白介素6（IL-6）受体单克隆抗体，由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞通过DNA重组技术制得。通过特异性的阻断IL-6受体，降低JAK/STAT3激活，可下调TH17细胞的生成，有利于缓解关节症状以及下调炎症因子(TNF-α、IL-17等)的表达，从而控制病情进展。那阻断IL-6/JAK/STAT通路会对JIA急性病程及细胞免疫、体液免疫产生怎样的影响？　　目前JIA发病机制仍不明了，研究表明RA急性期p-STAT3/STAT3持续表达，而抑制STAT3转录因子会导致RA滑膜纤维原细胞凋亡，细胞基质中有活性转录因子STAT3的RASF增值、抗凋亡和侵入能力均增强[3]，同时，STAT3可在IL-6、IL-23等炎症因子的刺激下磷酸化[4]，诱导滑膜成纤维细胞表达大量RANKL蛋白，从而促进破骨细胞产生，继而促进关节破坏[5]。IL-6/JAK/STAT异常激活的原因是什么？　　MicroRNA是一类非编码单链RNA，广泛存在于生命体中的一种正常调节机制，通过与靶mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)特异性结合，导致靶向mRNA降解或抑制其翻译过程，参与细胞发育、细胞增殖、分化和细胞周期等许多基本生物过程，还参与人类许多疾病的发病，包括癌症、代谢疾病、神经障碍、传染病及自身免疫病[6]。目前国内外已有多个研究表明多个miRNA，如miR-155[7]、 miR-146a[8]通过调节免疫细胞如T、B细胞的增殖和分化参与类风湿关节炎的发生。虽然最近几项随机对照研究表明，不少的miRNA在RA患者滑膜成纤维细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和T淋巴细胞均有不同程度的表达差异，其中包括miR-155, miR-19a, miR-203,miR-21，miR-124a[9-16]，但对其靶基因的分析及调控相关信号通路的机制仍不明了，同时，国内外针对JIA生物标记物相关的研究仍缺乏。这些miRNA是否参与JIA发病，是否与IL-6/JAK/STAT通路异常激活有关及如何产生影响，是否能够寻找某个miRNA作为JIA早期诊断及判断急性炎症的生物标记物，我们将在下面研究进一步探讨。　　2.目的　　1.研究IL-6受体拮抗剂（Tocilizumab）对儿童SJIA淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及生化指标的影响及总结其临床疗效及不良事件发生情况，以进一步揭示IL-6对SJIA中的作用。　　2.探讨miRNA调控IL-6/JAK/STAT通路相关蛋白（STAT3/p-STAT3/SOCS3）在JIA发病中的分子免疫机制，以进一步寻找JIA新型特异性生物标记物及治疗靶点。　　3.方法:　　1.回顾性分析2014年2月至2015年2月广州市妇女儿童医疗中心免疫科24例SJIA患儿的临床特征,包括基线数据、实验室检查结果以及治疗和不良反应情况，根据是否使用 Tocilizumab分2组，12例予 Tocilizumab+激素+DMARDs为Tocilizumab组，12例予安慰剂+激素+DMARDs为对照组，观察症状缓解情况，应用流式细胞术检测2组 SJIA用药12周前后 CD3+/CD4+/CD8+T、CD19+B、CD16+56-NK细胞比例。对比2组患儿免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE用药前后的变化，并观察连续用药12周炎症指标（CRP、ESR、FER、WBC）及ALT/AST变化、不良反应及激素减停情况进行归纳分析　　2.标本采集分两组病例组和对照组，病例组共33例活动期JIA患儿，按分型分为全身型组20例，关节型组13例，正常对照组20例，采集外周血，Ficoll法分离外周血单个核细胞（PBMC），提取和纯化miRNA，逆转录为cDNA；通过Targetscan和RNA22共同预测靶基因，设计引物，miR-19a、miR-21以U6为内参，STAT3、SOCS3、IL-6、TNF-αmRNA以β-Actin为内参，应用荧光定量PCR分别检测其组间表达，计算标准化后的2-δδT值表示miRNA的相对表达含量，非参数检验统计两组数据2-δδT的差异。构建miR-21慢病毒表达载体LV3-miR-21，转染至RASFs，用浓度0.01ng/mlIL-6刺激4h，Western Blot检测miR-21过表达组与对照组IL-6刺激前后p-STAT3/STAT3/SOCS3和GADPH蛋白表达量，计算灰度值，统计差异。　　4．结果:　　1.托珠单抗+DMARDs组，治疗12周后CRP、ESR、FER均明显下降，托珠单抗组CD4+T、CD19+B细胞的比例较基线降低（P<0.05），CD8+、CD3+T细胞比例较基线升高、2组CD16+56-NK细胞较基线变化不明显P>0.05，免疫球蛋白IgG、IgM、IgA较基线下降（P<0.05）。对照组均无显著差异（P>0.05）。并发症主要为上呼吸道感染，其次转氨酶升高，胆固醇、脂蛋白代谢异常（低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯水平升高）；2组均未发现严重不良反应（三系减少、重症感染等）。　　2.miR-19a、miR-21在病例组（全身型组和关节型在）均较对照组低表达（P<0.05），全身型组与关节型组间miR-21、miR-19a表达水平差异无统计学意义（p>0.05），预测显示与JAK/STAT通路相关的STAT3为miR-21、SOCS3、TNF-α为miR-19a的靶基因， STAT3、SOCS3、TNF-α、IL-6 mRNA较对照组表达升高(p<0.05)。病例组（全身型组和关节型在）miR-21与STAT3 mRNA表达呈负相关（p<0.05），miR-19a与TNF-α、SOCS3 mRNA表达呈负相关(p<0.05)。在RASF模型中转染慢病毒LV3-miR-21后，在IL-6刺激下，p-STAT3/STAT3较对照组表达下调，SOCS3上调，对照组在IL-6刺激下，p-STAT3/STAT3高表达，而在转染组则低表达。　　5.结论:　　1.Tocilizumab可大幅度降低炎症指标（CRP、ESR、FER），对ALT/AST、血脂代谢有影响，阻断IL-6可调节亢进的体液免疫及调节CD4+T、CD19+B细胞，减轻关节破坏。Tocilizumab可有效的控制DMARDs疗效不佳的SJIA病情发展；　　2.JIA中 miR-19a、miR-21表达水平的降低，提示与JIA发病有关；　　3.IL-6/JAK/STAT信号通路相关分子STAT3、SOCS3、TNF-αmRNA在JIA表达升高，提示JAK/STAT通路激活，参与JIA慢性炎症发生；　　4.miR-19a可能与JAK/STAT通路负中SOCS3/TNF-α表达调控有关；　　5.miR-21可调控STAT3的表达，抑制其磷酸化（p-STAT3低表达），负调控JAK/STAT通路。