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支链氨基酸(Branched-chain amino acid,BCAA)不仅是蛋白质合成的原料,也是重要的能源物质,通过氧化脱羧为机体提供能量。BCAA还可作为重要的信号分子参与机体的糖脂代谢。作为支链α-酮酸脱氢酶复合体(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex,BCKDH)的一个亚基,BCKDHA的异常可使BCKDH复合体功能发生障碍,导致BCAA及其代谢产物在体内聚集,进而降低丙酮酸和脂肪酸的运输和利用,干扰体内能量代谢。MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因mRNA进行完全或不完全的结合,对编码基因的转录后调控起重要作用。它们主要通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3‘UTR)结合抑制其翻译或使其降解。然而,有关BCKDHA的miRNA调控机制未见报道。为了解析BCKDHA基因在脂肪细胞分化中的作用以及miRNA调控机制,本研究利用生物信息学方法对BCKDHA基因的编码区序列(coding sequence,CDS)及其编码的氨基酸序列进行了分析。利用3个在线软件预测与该基因具有靶标关系的miRNAs。并对BCKDHA基因3’ UTR区构建双荧光报告载体,将其与筛选出的miR-194-5p的mimic一起转染到HEK293T细胞中,通过荧光活性的检测验证二者之间是否具有靶标关系。在绵羊SVF(stromal vascular fraction)细胞分化过程中过表达和抑制miR-194-5p,观察SVF细胞的变化。利用荧光定量PCR(qPCR)和Western blotting技术分别检测绵羊SVF细胞分化期间和过表达miR-194-5p后miR-194-5p、BCKDHA的mRNA表达量和BCKDHA蛋白的表达量,从RNA和蛋白两个水平上分析miR-194-5p与BCKDHA在前体脂肪细胞分化过程中的作用机制,并验证。主要结果如下:(1)绵羊BCKDHA基因CDS区长1344 bp,编码447个氨基酸。预测得出绵羊BCKDHA蛋白理论等电点为8.62,为碱性蛋白,相对分子量50.7 kDa,不稳定系数为41.68,是不稳定蛋白,无信号肽和跨膜域,含有10个O-糖基化位点、3个N-糖基化位点和24个磷酸化位点。靶基因预测结果表明miR-194-5p是调控BCKDHA表达的一个关键miRNA,其种子序列(2～8)碱基与BCKDHA 3UTR第190～196个碱基完全互补。(2)成功构建了 BCKDHA 3’UTR的双荧光报告载体。双荧光素酶活性检测显示,共转染pmir-BCKDHA和miR-194-5pmimic试验组的荧光活性极显著(P<0.001)低于对照组,说明miR-194-5p与BCKD 3’ UTR靶位点的结合抑制了荧光信号的产生。所以,miR-194-5p调控BCKDHA的作用机制是:miR-194-5p的种子区与BCKDHA基因3’UTR靶位点的完全结合下调了BCKDHA 表达。(3)用油红O染色观察转染miR-194-5p mimic和inhibitor后SVF细胞分化的变化。结果显示,转染miR-194-5p mimic组的脂滴明显少于转染miR-194-5p NC组、miR-194-5p inhibitor组和空白组。转染miR-194-5p mimic组和转染miR-194-5p inhibitor组差别较大,而转染miR-194-5p NC组稍少于空白组。这说明,miR-194-5p可以抑制SVF细胞分化,减少脂滴的形成。荧光定量PCR结果表明,在SVF细胞分化过程中miR-194-5p与BCKDHA的表达呈现相反的趋势,揭示了,miR-194-5p的高表达与BCKDHA的低表达密切相关,即miR-194-5p负调控BCKDHA的表达。(4)用 miR-194-5p mimic 转染 SVF 细胞后,miR-194-5p 的表达量升高,而BCKDHA mRNA的表达量降低,BCKDHA蛋白的相对表达量有所降低。而用miR-194-5p inhibitor转染SVF细胞后的结果与之相反。进一步证明了 miR-194-5p靶向BCKDHA基因3’UTR负调控其表达。