猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的新发病毒性传染病，主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病自从1987年在美国首次报道以来，现已遍及世界各主要养猪国家，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。 由ORF5基因编码的GP5蛋白是PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白之一，并能诱发最强的中和抗体，是研制PRRS新型疫苗的良好靶蛋白。但以天然ORF5基因构建的多种新型疫苗均难以诱发较早和较高水平的抗体，特别是保护性的中和抗体。分析其原因可能是位于GP5蛋白中和表位B(S³⁷H³⁸（L/I）³⁹Q⁴⁰（L/S）⁴¹I⁴²Y⁴³N⁴⁴L⁴⁵)之前的非中和表位A(（A／V）²⁷L²⁸V²⁹N³⁰)对中和表位产生了覆盖效应，导致中和表位不能充分暴露，从而不能有效诱发较高的中和抗体。鉴于此，本研究以PRRSV GP5蛋白为研究对象，首先在大肠杆菌中表达了ORF5基因不同区域缺失的突变体，建立了相应的ELISA诊断方法，并获得了1株针对GP5胞内区的单克隆抗体。在此基础上，针对表位A和表位B构建了一系列不同组合的ORF5基因突变体，探讨了这些突变体的免疫原性。具体研究内容如下： 1．ORF5基因不同区域缺失突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达 通过PCR方法构建了ORF5基因不同区域缺失的4种突变体，即ORF542（截去N端信号肽，编码26-200aa）、ORF552（截去N端信号肽和表位A，编码33-200aa）、ORF546（仅含表位A和表位B，编码26-66aa）和ORF556（仅含表位B，编码33-66aa）。将上述4种突变体分别插入原核表达载体pGEX-KG中，获得了4种原核表达质粒pKG-542、pKG-552、pKG-546和pKG-556。转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下，4种表达质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量分别为42kDa（GST-542）、41kDa（GST-552）、30kDa（GST-546）、29kDa（GST-556），并且均以包涵体形式存在。Western blot检测进一步证实表达产物均具有良好的反应原性。 2．单克隆抗体（McAb）的制备 将大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-552纯化后作为免疫原免疫Balb／c小鼠，建立了1株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株并且命名为52-C。分别利用表达的重组融合蛋白GST-542、GST-552、GST-546和GST-556进行间接ELISA和Westernblot分析，发现McAb 52-C能与GST-542和GST-552发生较强反应，而不与GST-546和GST-556发生反应，表明所获得的McAb 52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区。利用不同的抗鼠免疫球蛋白亚型抗体鉴定显示单抗52-C为IgG2a亚型。特异性试验证实，52-C不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（HCV）和猪口蹄疫病毒（FMDV）发生反应。中和试验检测发现McAb 52-C无中和活性。