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帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为黑质致密带(pars compacta of substantia nigra，SNc)多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性死亡和缺失，表达的酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)减少，使黑质-纹状体通路DA释放减少，造成纹状体多巴胺-乙酰胆碱失衡，患者出现静止性震颤、肌张力增高、运动减少等症状。随着社会人口的老龄化，PD的发病率呈逐年上升的趋势。由于PD的发病机制尚未研究清楚，临床上还没有一种药物最终表明可以减缓、阻止甚至逆转PD黑质DA能神经元的变性过程，探索有效的神经保护性治疗方案已成为目前PD研究的热点。多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]是一种核酶，动物实验证实PARP抑制剂对局灶性脑缺血、心肌缺血等心脑血管系统疾病具有保护作用，近年的研究表明PARP的活化也参与了PD的发病过程。凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)是一类存在于线粒体内外膜间隙的黄素蛋白，当细胞受到凋亡信号的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从线粒体转位到核内，引起细胞染色体的凝聚和DNA大的片段化，诱导细胞凋亡。动物实验证实，PARP的活化可诱导AIF的核移位。本研究应用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)制备PD动物模型，观察小鼠黑质DA能神经元数量、超微结构、细胞凋亡情况的变化和小鼠行为学指标的差异，检测小鼠黑质PARP活性、AIF的核移位和基因表达变化，探讨PARP活性改变在PD发病中的作用，并应用一种新型、高效的PARP抑制剂——PJ34对PD小鼠进行干预，首次在体研究PJ34对PD小鼠上述指标的影响，为PD的防治提供理论与实验依据。方法健康雄性2～3月龄C57BL小鼠，采用腹腔注射给药方式。小鼠随机分为4组：对照组、PJ34组、MPTP组和PJ34+MPTP组。造模后10min观察小鼠震颤、肌强直和运动减少情况，做爬杆试验、悬挂试验检测行为学指标，以证明PD小鼠模型制备成功与否及PJ34对PD小鼠行为学指标的影响。造模后2h、24h、72h时间点取材中脑，做TH免疫组化染色和尼氏染色观察小鼠黑质DA能神经元数量，透射电镜观察黑质DA能神经元超微结构的变化，PAR免疫组化染色和Westernblot方法检测黑质PARP活性改变，TUNEL染色观察黑质细胞凋亡情况，AIF免疫组化染色检测黑质AIF的核移位情况和蛋白表达水平，RT-PCR方法检测黑质AIF的mRNA表达变化，Western blot方法进行黑质AIF核移位的半定量分析。实验数据以均数±标准差((?)±s)表示，应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，两组间差异显著性用t检验判定，P＜0.05具有统计学意义。结果1、小鼠行为学检测结果MPTP组小鼠注射MPTP 3min后出现震颤、尾强直、爬杆缓慢、运动减少现象，持续约30min，证明PD小鼠模型制备成功。正常对照组和PJ34组小鼠无异常行为，PJ34对PD小鼠行为学指标有改善(P＜0.05)。2、尼氏染色和TH免疫组化染色检测结果对照组和PJ34组各时间点SNc区尼氏染色阳性细胞数和TH免疫阳性神经元(TH immunoreactive neurons，TH-IR)数较多，明显多于MPTP组相应时间点的阳性细胞数(P＜0.01)。MPTP组与PJ34+MPTP组SNc区尼氏染色阳性细胞数和TH-IR神经元数随时间呈递减趋势，PJ34+MPTP组各时间点的尼氏染色阳性细胞数和TH-IR神经元数明显多于MPTP组(P＜0.01)。3、电镜检测结果MPTP组小鼠黑质DA能神经元减少，存活DA能神经元损伤程度随时间加重，部分DA能神经元出现核膜内陷呈锯齿状，染色质凝块、边聚，线粒体肿胀、嵴不清，粗面内质网数量减少。PJ34+MPTP组黑质DA能神经元损伤程度明显减轻，线粒体形态基本未变，一些核膜轻度内陷，粗面内质网数量较MPTP组增加。对照组和PJ34组黑质DA能神经元形态正常。4、PARP活性检测结果免疫组化染色显示，对照组和PJ34组黑质几乎未见PAR合成，MPTP组SNc区细胞核内出现PAR合成，2h时达高峰，之后随时间呈下降趋势(P＜0.01)。PJ34+MPTP组SNc区PAR合成减少，与MPTP组各时间点对比有显著性差异(P＜0.01)。Western blot结果显示，对照组和PJ34组黑质未见PAR合成，MPTP组黑质核蛋白出现PAR合成，于2h时达高峰，之后随时间呈下降趋势，72h仍见少量PAR合成(P＜0.01)。PJ34+MPTP组黑质仅2h时可以检测到PAR特异性条带，PJ34+MPTP组与MPTP组各时间点对比有显著性差异(P＜0.01)。5、TUNEL染色结果对照组和PJ34组黑质几乎未见TUNEL染色阳性细胞核，MPTP组SNc区出现TUNEL染色阳性细胞核，2h时达高峰，之后随时间呈下降趋势。PJ34+MPTP组SNc区TUNEL染色阳性细胞核明显减少，与MPTP组各时间点对比有显著性差异(P＜0.05)。6、AIF核移位和基因表达检测结果免疫组化染色显示，对照组和PJ34组SNc区几乎未见AIF出现核移位，MPTP组SNc区出现AIF核移位，2h时达高峰，之后随时间呈下降趋势。PJ34+MPTP组SNc区AIF核移位明显减少。各组SNc区AIF蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)。Western blot结果显示，对照组和PJ34组黑质核蛋白未见AIF特异性条带，MPTP组出现AIF特异性条带，于2h时达高峰，之后随时间呈下降趋势(P＜0.01)。PJ34+MPTP组黑质仅2h时可以检测到AIF特异性条带，与MPTP组各时间点对比有显著性差异(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，各组各时间点黑质AIF的mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)。结论应用MPTP制备的PD模型小鼠SNc区出现PARP的过度活化，PJ34通过降低PARP活性，减少AIF核移位，降低细胞凋亡数量，减轻DA能神经元的超微结构改变，增加DA能神经元的存活率，改善小鼠的行为学指标，对PD模型小鼠发挥保护作用。PJ34对SNc区AIF的基因表达无影响。