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日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是黄病毒科的一员,是流行性乙型脑炎的病原,以蚊虫叮咬为主要的传播方式。乙型脑炎在临床上主要表现为高热,意识障碍,抽搐,行走困难,强直性痉挛等症状,部分病例预后不良,留有严重的后遗症。妊娠母猪患该病会出现流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍;公猪主要表现为一侧睾丸肿胀,部分后期萎缩失去生殖能力。该病有显著的时令性及一定区域性,夏季频发。日本脑炎病毒编码的多聚蛋白在翻译后被水解为C、prM和E 3个结构蛋白和7个非结构蛋白基因,可经过反转录、复制、转录、翻译成七个非结构蛋白:NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。NS1’蛋白是翻译过程中基因移码产生,JEV野毒株NS2A处存在基因为CCCUUUU的七联核苷酸滑动序列和序列后的二级茎环结构,在翻译过程中易发生移码,产生与NS1蛋白融合的NS1’蛋白,而疫苗毒SA14-14-2由于NS2A的G66A基因突变,破坏了茎环结构,因而不会产生NS1’蛋白,故NS1’蛋白是乙脑病毒野毒株特有的分子标志。本研究纯化JEV NS1蛋白的6F5单抗作为捕获抗体,纯化后偶联辣根过氧化物酶的JEV NS1、单抗3C2作为酶标检测抗体,在此基础上初步建立检测JEV NS1’蛋白的DAS-ELISA方法。大肠杆菌原核表达的JEVNS1、NS1’蛋白作为本方法的阴阳性标准品,绘制标准曲线,初步确定其检测灵敏度和线性范围。利用本ELISA方法检测不同毒株感染的细胞上清和攻毒小鼠血清,观察本方法的敏感性和特异性,研究结果如下:1、JEVNS1’蛋白及酶标NS1’单抗的制备与鉴定为获得JEV NS1’重组蛋白,设计引物扩增JEV NS1’基因,通过酶切克隆入pET28a载体中,后转化入E.coliDH5α中,经聚合酶链式反应、酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒转化入E.coliR2感受态中,小量诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达。本实验中大肠杆菌以包涵体方式表达了 JEVNS1’蛋白,蛋白大小约为50kd。用间接ELISA方法检测实验室保存的JEVNS1’单抗6F5效价,选择纯度效价最高的单抗与辣根过氧化物酶偶联,后再次检测效价。标记单抗在偶联前效价为1:204800,偶联后降为 1:16000。2、以单抗为捕获抗体建立检测JEV NS1’的DAS-ELISA及其标准曲线的制作以方阵滴定法确定单抗的包被浓度,在此基础上建立起以单抗为捕获抗体的双抗体夹心ELISA方法,并对其检测条件进行优化,所得的最佳反应条件为:纯化的鼠源JEV NS1蛋白单抗作为捕获抗原,包被浓度为10μg/mL;用3%BSA的磷酸缓冲液封闭,37℃作用2h;样品37℃作用1.5h;HRP标记鼠源JEVNS1’蛋白单克隆抗体1:2000稀释37℃作用1h。该DAS-ELISA方法检测灵敏度为0.027μg/mL,当重组蛋白浓度为10μg/mL时曲线趋于平缓,当重组蛋白浓度为0.05μg/mL～0.4μg/mL时,线性关系基本处于直线,线性方程为y=1.003x+0.249,r=0.999,有较好的相关性,而JEVNS1蛋白均检测不出。该DAS-ELISA方法灵敏度较高,可用于JEV野毒感染人和动物的早期检测。3、应用检测JEV NS1’的DAS-ELISA检测细胞毒及动物血清样品应用上述建立的DAS-ELISA检测JEV NJ2008株感染BHK细胞中的NS1’蛋白,能够有阳性检出,但OD值不高。未经处理的和经不同浓度NP-40和TrisonX-100处理不同时间,其OD值提升不显著,经加热处理（血清与DEPC水1:2混匀,煮沸5min）后,其OD值显著提升,能达到0.7左右。取5只小鼠,分别以0、102、103、104、105 PFU腹腔接种JEVNJ2008毒,只有接种105 PFU的小鼠血清用本ELISA检测结果为阳性,与荧光定量检测血液中病毒核酸的结果一致。用该DAS-ELISA检测来自不同省份的307份猪血清样品,总阳性率为14.0%。蚊虫的相对活跃的9月（19.6%）、10月（23.3%）猪JEV的野毒感染阳性率明显高于2月（5.6%）,结果表明JEV的传播具有明显的季节性。对其中背景清晰的9、10月份165份血清进行检测,结果表明浙江（29.7%）、山东（38.7%）两省猪血清的JEV野毒感染率阳性率明显高于江苏（9.8%）、河北（15.3%）两省,呈一定的地域性,保育仔猪猪血清的阳性率高于产仔仔猪和后备猪。