研究背景：肺癌是严重威胁人类生存健康的恶性肿瘤之一,在美国,肺癌的发病率位居各种肿瘤发病率首位。部分患者被确诊为肺癌时即处于中晚期,丧失手术机会,目前针对肺癌的非手术治疗方案主要包括化疗、放疗及新兴的靶向治疗,但其临床效果欠佳,预后较差。基因介导的酶前体药物治疗肿瘤的方法,即自杀基因疗法前景宽阔,自首次发现以来便受到学者的高度关注。研究较为深入的自杀基因系统包括：单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷系统(HSVTK I/GCV)、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、硝基还原酶/5-(aziridin-1-y I)-2,4-dinitrobenzamide[5-(1-氮丙啶)-2,4-二硝基苯甲酰胺]系统(NTR/CB1954)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶/6-巯基黄嘌呤系统、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷酸系统等。其中,NTR/CB1954自杀基因系统因其独特的作用特点及优势,具有更为广阔的应用前景。1967年,CB1954由英国Chester Beatty实验室首次合成,它是一种作用微弱的烷化剂,对肿瘤细胞发挥较弱的杀伤效应。研究发现,CB1954对Walker Rat256肿瘤细胞具有较明显的杀伤作用,原因在于Walker rat 256细胞内含有二磷酸吡啶核苷黄递酶(DT-diaphorase),可以对CB1954发挥强大的分解代谢作用,其代谢产物即4-hydroxylamino derivative可使细胞内DNA交联从而促使Walkerrat 256肿瘤细胞产生明显的凋亡及坏死。进一步研究发现,CB1954对于大肠杆菌也具有较强的杀伤力,或导致大肠杆菌基因组的突变,这是因为大肠杆菌内存在的一种代谢酶,即硝基还原酶(nitroreductase, NTR), NTR作用于CB1954的还原产物可以导致大肠杆菌的死亡。大肠杆菌体内的硝基还原酶由nfsB基因编码,与D T-diaphorase相比,NTR对CB1954还原活性要高出60倍,因此,大肠杆菌体内的硝基还原酶更具的研究价值。NTR作用于CB1954生成两种物质：4-羟氨基-2-硝基苯甲酰胺和2-羟氨基-4-硝基苯甲酰胺,前一种产物在细胞内辅助因子的作用下进一步代谢成为具有细胞毒性的物质,可引发肿瘤细胞的DNA发生链内交联、断裂,且难以修复,从而诱导肿瘤细胞凋亡,而凋亡是大部分肿瘤细胞死亡的主要形式。NTR/CB1954自杀基因系统的特点及优势：多种实验研究证实,与HSV-TK/GC、CD/5-FC相比,NTR/CB1954自杀基因系统不仅对增殖期的肿瘤细胞具有杀伤效应,而且对于静止期的细胞同样具有杀伤效应；研究证实,在NTR/CB1954自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤过程中,能够特异性的上调p53蛋白的表达,从而增强p53介导的肿瘤细胞凋亡作用,p53基因是一种重要的抑癌基因,人类约50%以上的肿瘤与p53基因变化有关；NTR/CB1954自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤效应速度较快,W Cui等发现,它作用于乳腺癌细胞的第7个小时,便可观察到凋亡现象,17个小时达到作用高峰,而HSVTK/GCV自杀基因系统则需要几天甚至几周的时间才能达到相似的效应；CB1954具有强大的旁观者效应(bystander effect),其还原产物能够自由的通过细胞膜,在少量硝基还原酶的作用下即可达到杀死肿瘤的效果；最后,CB1954与其他的化疗药物或前体药物之间不存在交叉耐药性。研究目的：近年来大量实验表明,NTR/CB1954自杀基因系统在对多种恶性肿瘤细胞(乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等)均具有杀伤效应,但是,针对NTR/CB1954自杀基因系统对肺癌细胞的相关研究较为罕见。本实验旨在探讨NTR/CB1954自杀基因系统对Lewis肺癌细胞的杀伤作用。首先,于体外环境下,检测NTR/CB1954自杀基因系统对Lewis肺癌细胞的杀伤效应；然后,建立Lewis肺癌细胞动物模型,于体内环境下,检测NTR/CB1954自杀基因系统对Lewis肺癌细胞的杀伤效应。收集整理实验结果,明确NTR/CB1954自杀基因系统在体外、体内环境下对Lewis肺癌细胞的杀伤效应,初步得出实验结论,为肺癌的治疗探索新的方法提供初步实验证据。研究方法：本实验以nfsB基因作为硝基还原酶的基因,选取大肠杆菌Escherichia coliK12作为基因来源的菌株,设计nfsB基因合成引物,利用基因重组技术,将nfs8基因与真核表达载体构建重组载体,真核表达载体为pCDNA3,将获得的新的重组载体命名为pCDAN3-nfsB载体。自液氮中取出Lewis肺癌细胞,去冻存液,常规培养至细胞贴壁,待细胞融合度达80%传代。利用脂质体转染的方法,将空载体pcDNA3以及重组载体pcDNA3-nfsB转染Lewis细胞,利用G418(一种氨基糖苷类抗生素)筛选的原理,得到稳定表达硝基还原酶的细胞株,命名为pcDN A3-nfsB-Lewis细胞,而空白对照载体pcDNA3稳定转染的细胞则命名为pcDNA3-Lewis细胞。实验细胞分为三组：Lewis细胞、pcDNA3-Lewis细胞和pcDNA3-nfsB-Lewis细胞。RT-PCR法检测pcDNA3-nfsB-Lewis细胞硝基还原酶基因相对表达水平,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技术检测其蛋白表达水平。台盼蓝染色法,观察Lewis细胞、pcDNA3--Lewis细胞和P cDNA3-nfsB-Lewis细胞的生长情况,并绘制各组细胞的生长曲线,明确转染前后对细胞生长的影响。向各组细胞添加30umol/L CB1954,观察细胞凋亡率与作用时间的关系；再将各组细胞分别用不同浓度的CB1954(0μmol/L,12.5μmol/L)处理,36小时后检测细胞死亡的剂量效应,检测不同浓度的CB1954对各组细胞的作用差别。Hoechest33258/PI荧光染色方法检测各组细胞凋亡率,MTT方法检测各组细胞的存活和生长活性。以C57BL/6小鼠为研究对象,建立移植肿瘤动物模型。在C57BL/6小鼠颈部注射Lewis细胞,待一周左右,瘤体可生长至黄豆粒大小水平,处死小鼠,取出瘤体,将其剪成小块,取组织悬液注射C57BL/6小鼠的右后肢皮下注射1×106活细胞,约一周左右瘤体可长到黄豆大小。将移植瘤动物进行随机分成三组：瘤内转染重组质粒pcDNA3-nfsB组、空载体pcDNA3组及未转染任何质粒组,对三组动物腹腔注入CB1954,比较各组实验动物不同时间点瘤体的大小,以及各组实验动物存活的时间。研究自杀基因系统在体内中对肿瘤的杀伤效应。计量资料以X±s表示,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,所有数据均采用SPSS 18.0进行统计分析,P<0.05表示具有统计学差异。研究结果：利用人工设计引物,成功克隆出正确的nfsB基因,由Escherichia coli 5α进行基因扩增、保存。应用基因重组技术,将真核表达载体pcDNA3与目的基因nfsB重组连接后,通过酶切、测序鉴定,成功构建了重组质粒pcDNA3-nfsB,转染Lewis细胞后,通过抗生素G418的浓度梯度筛选,最终成功筛选出能够稳定表达硝基还原酶的Lewis细胞,并通过RT-PCR的方法,扩增目的基因nfsB的部分序列nfsB1(大小约381bp),经琼脂糖凝胶电泳,得到了381bp的条带,在RNA水平证实Lewis肺癌细胞能够正确表达目的基因nfsB。检测pcDNA3-nfsB-Lewis细胞、pcDN A3-Lewis及Lewis细胞三种细胞的增殖情况,结果显示三组细胞增殖无明显差别,P>0.05。向各组细胞添加30umol/LCB1954,12小时后pcDNA3-nfsB-Lewis细胞即发生明显的凋亡,第36小时凋亡率达到高峰,且明显高于另外两组,具有统计学意义(P<0.01)；pcDN A3-Lewis细胞与Lewis细胞的凋亡率无明显差别。将CB1954配制成不同浓度(0μmol/L, 12.5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L),对三组细胞进行处理,36小时后,检测发现pcDNA3-nfsB-Lewis细胞出现明显的凋亡,且凋亡率为浓度依赖性,当浓度达到50umol/L时,细胞的凋亡率达到最大,与另外两组细胞相比差异显著(p<0.05),而另外两组细胞并未出现明显的凋亡。通过MTT法检测NTR/CB1954自杀基因系统对细胞的增殖影响,结果显示：pcDNA3-nfsB-Lewis细胞OD570明显低于另外两组细胞(P<0.05),在CB1954浓度0～50μmol/L 之间呈浓度依赖性。Lewis肺癌肿瘤细胞动物模型建立成功后,经CB 1954腹腔注射后的第12天、15天,pcDNA3-nfsB瘤内转染后的小鼠,其肿瘤体积生长呈现为相对缓慢的趋势,瘤体大小分别为589.9±19.00mm3、793.6±96.42mm3,未转染基因组为1106.2±91.83mm3、1649.1±67.79mm3, pcDNA3组为1131.3±60.16mm3、 1441.6±224.5mm3,前组生长明显慢于后两组,具有统计学差异,P<0.05。pcDNA3-nfsB瘤内转染后的肿瘤小鼠动物生存的时间较长(41.63±7.07天),而转染了空载体pcDNA3组及未转染质粒组小鼠的生存时间分别为27.86±4.94天、26.75±5.97天,前组明显长于后两组,具有统计学意义,P<0.05。研究结论：NTR/CB1954自杀基因系统可以使Lewis肺癌细胞产生明显的凋亡现象,且在第7小时即发挥作用,第36小时达到杀伤作用的高峰,这种杀伤作用对CB1954呈现浓度依赖,随着CB1954浓度的增加,其杀伤作用不断增强。在动物实验中,NTR/CB1954自杀基因系统,能够有效控制Lewis肺癌细胞的增殖,并显著延长实验动物的生存时间。本研究初步证实NTR/CB1954自杀基因系统在体内、外环境下,均能够对Lewis肺癌细胞产生具有明显的杀伤效应,为未来通过自杀基因疗法治疗肺癌,奠定了初步实验基础。