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研究背景:精子DNA完整性的损伤是现代男性常见的精液异常,是导致男性生育力下降的主要因素。精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index,DFI)是判断精子DNA损伤的常用指标。目前对于特定基因甲基化以及时间节律变化与精子DNA完整性的关系仍不清楚。第一部分 人精子印迹基因的异常甲基化与DNA损伤的关系研究目的:分析精子DNA损伤与印迹基因甲基化的相关性。方法:收集66例人精液样本,精子染色质结构分析测定DFI,并检测印迹基因H19、IGF2、KCNQ1、MEG3、MEST、PEG3和SNRPN 的甲基化水平,分析其甲基化与精子DNA损伤的关系。结果:与低DFI组相比,高DFI组精子印迹基因IGF2(cg17037101)位点的甲基化显著降低(13.7±3%vs.31.5±5.3%,P=0.0053)。而其余印迹基因的甲基化水平无显著变化。相关性分析表明,IGF2(cg17037101)甲基化水平与精子 DFI 呈负相关(r=-0.448,P=0.0038),而KCNQ1(cg24932449)甲基化水平与精子DFI呈正相关(r=0.354,P=0.0273)。结论:IGF2和KCNQ1基因的甲基化水平变化可能与人精子DNA损伤有关。第二部分人精子DNA损伤的全基因组甲基化谱及BRCA1基因的功能研究研究目的:通过全基因组甲基化芯片筛选与精子DNA损伤相关的差异甲基化基因,并分析BRCA1基因的功能。方法:收集20例人精液样本进行全基因组甲基化芯片分析,并利用目标区域甲基化测序技术检测267个精液样本BRCA1基因启动子上24个CpG位点的甲基化水平;定量PCR分析BRCA1基因表达。进一步利用siRNA敲除小鼠精母细胞GC-2中BRCA1的表达,研究其对细胞增殖、凋亡以及yH2AX焦点形成的影响。结果:通过无监督分层聚类方法可以将精子样本分为高中低(H、M、L)DFI三组,并发现在L vs.M、M vs.H和L vs.H组之间分别存在959、738和937个差异甲基化区域。GO功能分析主要富集于涉及配子生成的DNA甲基化、男性减数分裂期的核分化、男性减数分裂I、P颗粒和pi-body等。目标区域甲基化测序发现BRCA1基因多个CpG位点在高低DFI两组中存在显著甲基化差异;相关性分析发现CpG4、CpG11和CpG20甲基化水平与精液DFI显著相关;并且高DFI组中BRCA1表达降低。在精母细胞GC-2中敲低BRCA1表达可抑制细胞增殖并显著降低H2O2处理后的细胞存活率,增加H2O2诱导的细胞凋亡和γH2AX焦点形成。结论:提示精液中高DFI与DNA甲基化异常相关,BRCA1基因的异常甲基化及表达降低在男性生殖细胞的DNA损伤中可能起重要作用。第三部分时间节律对精子DNA完整性的影响目的:探讨精子DFI在小鼠模型和男性精子中的时间节律变化。材料与方法:成年雄性小鼠24小时内连续6个时间点收集精子,检测DFI变化。收集生殖医学中心男性门诊患者和社区大学生人群共11382份精液样本。生殖医学中心人群于上午7点至11点采集精液,大学生人群于上午8点至20点采集精液,并测定DFI,分析射精时间点与DFI的关系。结果:小鼠精子DFI时间变化呈余弦模式分布,上午10点为最低点。大学生人群中,精子DFI的时间变化也符合余弦模式分布,峰值位于-343°,表明在上午11点为DFI最低点。生殖医学中心人群数据显示,早上7点到11点DFI呈下降趋势。对于有多次样本收集的患者,不同时间点比较也显示上午7点后DFI连续降低。结论:精子DFI可能发生时间节律的变化。