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UDP-N-乙酰葡糖胺是生物体内重要的活性核苷糖,可被大量用于寡糖的生产,进而被开发成医药品或功能性材料。但由于其生产方法的限制,目前其供应量仍较小,价格也很高。因此,本工作的首要目的就是找到一条低成本、高效率的UDP-GlcNAc合成方法。本文首先构建了三个带有His6标签的表达载体pET28-yqgR(葡萄糖激酶)、pET28-agml(磷酸乙酰葡糖胺异构酶)和PET28-glmU(1-磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶),并以Rosetta(DE3)为宿主菌实现了过量表达。利用干酵母和上述三个蛋白构成的多步酶催化反应体系,能够以GlcNAc和UMP为底物合成UDP-GIcNAc,其中干酵母的作用是将UMP生成UTP。经过对合成反应底物浓度、反应温度、反应时间等条件的优化,50 mM GlcNAc和50 mM UMP在20℃下反应72 h后,能得到31.5 mM的UDP-GlcNAc。相比于体内表达三个酶蛋白,运用无细胞蛋白合成体系则显得更方便、快速。故研究在无细胞蛋白合成体系中重建这三酶反应组成的UDP-GlcNAc生物合成途径。文中构建了六个用于无细胞体系表达的带有His6标签的表达载体pIVEX2.4c-yqgR、pIVEX2.4c-agm1、pIVEX2.4c-glmU和pSJ2-yqgR、pSJ2-agml、pSJ2-glmU。将三个酶分别用无细胞体系表达后再进行合成反应,40 mM GlcNAc在20℃下反应24h后,生成4.1 mM的UDP-GlcNAc。用同一无细胞反应体系进行三酶的共表达,表达产物用于合成产物,在相同反应条件下生成1.9 mM的UDP-GlcNAc。试验结果表明无细胞体系能实现多个蛋白的功能性共表达,并重建UDP-GlcNAc合成途径,进而说明它能成为一个重建代谢途径和小代谢网络的理想研究体系。