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目的Ski作为进化保守蛋白,广泛存在于不同的细胞和组织中。我们课题组前期动物实验已证实Ski分子在大鼠脊髓损伤后的星形胶质细胞中表达增高,提出Ski可能调控脊髓损伤后反应性星形胶质增生过程的科学假设。本研究探讨Ski在体外培养的大鼠星形胶质细胞中的表达变化规律及其对星形胶质细胞生物学活性的影响。方法提取新生SD乳鼠大脑皮质,分离星形胶质细胞,体外培养。采用LPS刺激和细胞划痕损伤2种方法活化星形胶质细胞,均采用Western blot法检测各个相应时间点2种活化星形胶质细胞中Ski、GFAP、PCNA、CDK4和CyclinD1的表达变化,采用间接免疫荧光法检测Ski蛋白在星形胶质细胞中的表达定位。为深入探究Ski分子对星形胶质细胞生物学功能的影响,购买Ski基因小干扰RNA1、2、3和阴性对照小干扰片段。实验分组:Ski-siRNA-1组,Ski-siRNA-2组,Ski-siRNA-3组,阴性对照组和空白对照组,首先转染带有荧光标记的阴性对照小干扰RNA检测转染效率,采用Western blot法检测Ski蛋白的沉默效果以筛选最佳干扰序列;Western blot法检测沉默Ski基因后GFAP、PCNA、CDK4和Cyclin D1蛋白的表达情况;CCK8细胞活力实验和EdU染色法检测沉默Ski基因后对星形胶质细胞增殖活力的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化;采用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测沉默Ski基因后对星形胶质细胞迁移能力的影响。结果GFAP和PCNA蛋白在星形胶质细胞中固有表达,LPS活化和划痕损伤后二者表达均上调。Ski在正常星形胶质细胞中呈低表达状态,1?g/m L LPS活化星形胶质细胞后,Ski表达开始增加,4 d时表达量最高(P<0.05),6 d时开始下降,但仍高于未活化组;同时,PCNA,CDK4和Cyclin D1蛋白在活化星形胶质细胞中的表达趋势同Ski蛋白表达趋势基本一致。细胞划痕损伤后Ski蛋白在活化星形胶质细胞中的表达情况与上述情况高度一致。此外,免疫荧光染色显示,在正常和活化的星形胶质细胞中,Ski蛋白的表达与GFAP,PCNA的表达呈正相关。上述结果均提示Ski在星形胶质细胞增殖能力方面起到重要调控作用。为深入研究Ski基因的功能,我们采用干扰RNA技术沉默星形胶质细胞中Ski基因的表达,结果显示,细胞转染72小时后,转染效率达到80%,Ski-siRNA-3组中Ski蛋白表达量最低(P<0.001);在沉默Ski基因后,GFAP、PCNA、CDK4和CyclinD1的表达量均明显降低(P<0.05),CCK8实验和EdU染色均发现细胞增殖活力明显降低(P<0.05);流式细胞术检测细胞周期结果显示,Ski-siRNA-3组细胞G1期比例明显增加,S期细胞比例明显减少(P<0.05)。此外,细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验均提示,沉默Ski基因后星形胶质细胞迁移能力明显下降。结论Ski蛋白表达于星形胶质细胞,主要聚集在细胞核中。本实验首次证实在活化星形胶质细胞中,Ski表达与细胞增殖相关蛋白PCNA表达量呈正相关;说明Ski蛋白可能调控星形胶质细胞的活化、增殖等过程。在敲除Ski基因后,星形胶质细胞的增殖能力和迁移能力均被显著抑制,提示Ski分子参与调控星形胶质细胞的活化、增殖和迁移过程。