放射性口干症是鼻咽癌等头颈癌放射治疗后的常见后遗症，放射治疗会损伤涎腺腺泡细胞（salivary gland acinar cells，SGACs）从而引起涎腺分泌功能的减低，导致患者出现口干、吞咽困难、龋齿、真菌感染、营养不良，睡眠障碍等症状，这会严重影响病人的生存质量。迄今为止临床上尚无有效的手段预防和治疗放射性口干症。 近年来，随着干细胞医学和组织工程技术的进步和发展，给涎腺放射性损伤的再生修复带来了希望，理论上认为：需要放射治疗的头颈肿瘤病人于放疗前收集自体的涎腺细胞，经体外培养扩增，并生长于可降解支架，制备出具有分泌功能的涎腺组织，放疗后再移植回病人体内以恢复涎腺的分泌功能。但涎腺的再生医学也存在如下一些问题：SGACs为高度分化的上皮细胞，在体外不易长期培养；另外自体的种子细胞数量有限，从而限制了涎腺组织工程的临床应用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新与增殖分化能力的多潜能细胞，可从病人自体的骨髓中分离而得，经过体外扩增可获得足够的数量，被认为是组织工程的首选细胞。为此，探讨研究MSCs定向分化为有分泌功能的SGACs，这将为干细胞治疗放射性口干症开辟新的途径。 研究目的：应用非接触共培养技术，探讨能否将MSCs定向分化为有分泌功能的SGACs，为将MSCs作为涎腺组织工程的种子细胞以及最终应用于治疗放射性口干症提供新途径。 材料与方法： 1．SD大鼠SGACs的分离、培养和鉴定 应用胰酶消化法进行SD大鼠SGACs的分离、纯化，然后进行SGACs的原代培养和传代培养；相差显微镜下观察SGACs的形态学特征；采用淀粉酶试剂盒法检测各代SGACs的淀粉酶含量，证明培养的SGACs具有分泌功能，同时选择分泌功能较好的培养细胞用于共培养；采用免疫细胞化学的方法检测细胞是否表达淀粉酶抗体以证明实验所分离SGACs来源于涎腺。 2．SD大鼠MSCs的分离、培养和鉴定 全骨髓培养法进行SD大鼠MSCs的分离，纯化，然后进行MSCs的原代培养和传代培养；相差显微镜下观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测表面抗体CD29、CD44、CD45；再将MSCs诱导成脂肪细胞以证明所分离细胞具有多向分化潜能。 3．共培养系统下诱导SD大鼠MSCs定向分化为SGACs 取SGACs第二代和MSCs第一代按4：1的比例共培养，共培养时两种细胞并不直接接触，但条件培养基共用；应用免疫细胞化学方法鉴定MSCs定向分化后的腺泡样细胞是否表达SGACs特征性的淀粉酶抗体；共培养2周，每周均将底层的MSCs置于相差显微镜下观察，并与正常SGACs比较。同时进行免疫细胞化学和免疫荧光检测，了解其细胞内淀粉酶抗体的表达，并计算10个高倍视野中阳性细胞的数量（10～30个每视野）。 4．统计学处理 使用SPSS13．0统计软件，采用单因素方差分析各代SGACs培养基中的淀粉酶浓度，多重比较采用LSD法。共培养后的MSCs淀粉酶抗体阳性细胞计数用X±S％表示，采用两独立样本t检验，P<0．05为差异有统计学意义。 结果: 1．SD大鼠SGACs的鉴定 1．1原代的SGACs于倒置显微镜下观察，约48小时后体外培养的细胞形成克隆，呈卵圆形，一般需要6～8天长满单层，原代和第一代的差速粘附法去除成纤维细胞后，得到较为一致的SGACs，显微镜下观察呈圆形、椭圆形或多边形，排列密集，鹅卵石样外观，胞浆丰富，可见分泌性颗粒。 1．2原代至第五代的SGACs的淀粉酶含量：将各代的SGACs培养基收集，淀粉酶试剂盒法检测其淀粉酶浓度，以了解各代细胞的分泌功能，同时通过这种特异性的功能检测，证明其细胞来源。统计学显示，不同代之间的淀粉酶含量不全相同（F=40．38 P=0．00）。另外，LSD法多重比较显示，第二、三代的淀粉酶浓度与其他各代的差异有显著意义（P<0．05）。因此将第二代SGACs用于共培养。 1．3免疫细胞化学染色取第二、三代SGACs爬片后固定，加淀粉酶抗体（Amylase—G10，SANTA Inc，cat NO．sc—46657），DAB显色结果强阳性，主要位于胞浆；对照组不加淀粉酶抗体，结果阴性。 2．SD大鼠MSCs的鉴定 2．1相差显微镜下MSCs呈梭形，纺锤状，细胞形态均一，排列呈束状、漩涡状。 2．2流式细胞仪检测CD29阳性（纯度为98．73％）、CD44阳性（纯度为94．88％）、CD45阴性（纯度为6．39％），符合MSCs的表面抗体特征。 2．3 MSCs在诱导液的培养下第三周，约70％的细胞发生了转化，油红—O染色阳性，镜下可见脂滴，证明提取的是有多向分化潜能的MSCs。 3．共培养后SD大鼠MSCs定向分化的腺泡样细胞鉴定 共培养开始后，于第一、二周进行显微镜下形态学观察，同时对下层细胞进行免疫细胞化学和免疫荧光检测，分析显示共培养后部分MSCs的形态学发生变化，类似腺细胞的多角形，胞浆丰富，而对照组细胞仍为梭形，且共培养后MSCs的淀粉酶抗体染色阳性，对照组阴性。另外，通过计算，共培养后1周29．2±6．0％的腺泡样细胞有淀粉酶抗体表达，而2周后约52．9±9．3％细胞显色，实验组中两周的阳性细胞计数差异有统计学意义（P<0．05）。 结论: 1．体外成功构建SD大鼠的SGACs培养体系，其中第二代和第三代的SGACs可用于共培养的实验。 2．体外成功分离培养SD大鼠的MSCs，经成脂诱导实验证明其具有多向分化潜能。 3．MSCs与SGACs共培养条件下可向SGACs转化，转化后的细胞表达淀粉酶抗体。